Estandarización de un método fluorométrico para la determinación de la densidad parasitaria por Plasmodium en modelos farmacológicos de malaria in vivo e in vitro

Abstract

La eficacia in vivo e in vitro de potenciales antimaláricos generalmente es evaluada mediante la determinación microscópica directa de la parasitemia de Plasmodium en extendidos de sangre teñidos con Giemsa. Este proceso es subjetivo, consume mucho tiempo, carece de precisión y requiere de personal técnico experimentado. En el presente estudio hemos adaptado y optimizado un método basado en la fluorescencia del SYBR Green I (SGI). La sincronicidad (para el cultivo de P falciparum), el uso de sangre entera (Whole blood cell_WBC) frente a células rojas infectadas (para el modelo in vivo), y los parámetros de lisis y el tiempo de tinción (en ambos modelos) fueron examinados para definir las condiciones óptimas. El tiempo de tinción fue robusto entre 5 minutos y 4 horas (2 horas óptimo); el cultivo asincrónico del parásito permite evaluar las concentraciones más bajas y la WBC no interfiere. Bajo condiciones experimentales óptimas, el ruido de fondo generado es bajo, hay buena linealidad (dentro de los rangos de parasitemia empleados comúnmente en estos modelos farmacológicos). El método de Bland-Altman evidenció una fuerte correlación entre el método SGI y el estándar Giemsa. El Factor Z fue 0,5Z0 para el modelo in vitro y Z0,5 para el modelo in vivo, lo que confirma que el método es apropiado para el cribado de alto rendimiento. Estos hallazgos sugieren que nuestro método alternativo basado en la fluorescencia es adecuado para la evaluación in vitro e in vivo de sustancias o extractos con posible actividad frente a malaria.

Abstract. The in vitro and in vivo efficacy of potential antimalarials is usually assessed by direct microscopical determination of the parasitaemia of Plasmodium infected red blood cells on Giemsa stained blood smears. This process is subjective, time consuming, lacks accuracy and requires experimented technicians. In the present study we adapted and optimized a SYBR Green I (SGI) fluorescence-based method. The synchronicity (for the culture of P falciparum), the use of whole blood-cells (WBC) versus isolated infected red blood cells (for the in vivo model), and the lysis parameters as same as the staining time (for both models) were examined to define optimal conditions. In our hands staining incubation time ranged from 5 minutes to 4 hours (2 hours being optimal); in vitro asynchronous parasite culture allows to assess lower concentrations and WBC did not interfere. Under optimal experimental conditions, the background generated was low; the linearity is good (within the ranges of parasitaemia commonly employed in these pharmacological models). The Bland–Altman plot showed a strong correlation between SGI and standard Giemsa method. Z factor was 0,5Z0 for the in vitro model and Z0,5 for in vivo model, confirming that the method is appropriate for high-throughput screening. These findings suggest that our alternative fluorescence-based assay is suitable for in vitro and in vivo anti malarial drug assessment.