An enantiomeric study of salsolinol involvement in ethanol brain reinforcing effect, via the activation of the gi pathway of μ-opioid receptors

Abstract

El efecto reforzante del etanol contribuye a la generación de dependencia. Para que el etanol sea reforzante se requiere que este se metabolice a acetaldehído en el cerebro, el cual activa neuronas dopaminérgicas en el área del tegmento ventral (VTA). No se conoce si el acetaldehído se une a un receptor para ser reforzante, pero se puede condensar con dopamina para formar salsolinol racémico [(R) y (S)-SAL]. Se ha propuesto que SAL ejerce el efecto reforzante del etanol, ya que es un reforzante potente si se administra intracerebralmente. Además, los niveles cerebrales de SAL aumentan luego de una administración de etanol crónica a ratas. Si la administración de etanol es aguda no se observa SAL cerebral a menos que el metabolismo de acetaldehído esté inhibido. El mecanismo de acción de SAL podría ser a través de receptores de opioides μ (μOR) ya que SAL desplaza ligandos de estos receptores, aunque no existe evidencia de una acción directa de SAL sobre μORs. Este trabajo apuntó a determinar si SAL producido luego de una dosis aguda de etanol activa el sistema de recompensa de ratas naïve a través del efecto de uno de sus enantiómeros (R o S) sobre μORs. Experimentos basados en células transfectadas mostraron que SAL activa μORs vía proteína Gi sin reclutamiento de β-arrestina, y que (S)-SAL purificado es 50 veces más potente que (R)-SAL. Para apoyar estos resultados realizamos simulaciones computacionales de (R) y (S)-SAL dentro del sitio de unión del μOR mediante dinámica molecular. Estas simulaciones nos permitieron explicar que la especificidad enantiomérica observada experimentalmente se debe a la interacción del metilo quiral de (S)-SAL con la Y148 del μOR, interacción que no fue estable para (R)-SAL. Las simulaciones mostraron que (S)-SAL, una molécula pequeña en comparación con todos los otros agonistas opioides, no puede interaccionar con todos los residuos calificados como importantes para la activación de μORs, mostrando que el (S)-SAL es un agonista muy particular de este receptor. A continuación, determinamos si la administración de (R) o (S)-SAL en el VTA de ratas activa su sistema de recompensa cerebral. La infusión de (R) y no de (S)-SAL en el VTA indujo una preferencia de lugar condicionada en ratas. El mecanismo para este efecto de (R)-SAL podría ser distinto a un agonismo de μORs, ya que (S)-SAL no indujo este efecto a pesar de ser el enantiómero más potente para agonismo en μORs. El siguiente objetivo fue determinar mecanismos de eliminación que explicaran la gran dificultad en la detección de SAL en el cerebro, a pesar de que se forma in vitro a pH 7,4. La actividad de SAL sobre el transportador de dopamina se estudió mediante ensayos basados en células transfectadas y encontramos que concentraciones milimolares de SAL eran necesarias para que fuera un ligando de este transportador, indicando que una recaptación por el transportador de dopamina no es un mecanismo relevante de eliminación de SAL. Para determinar el efecto de una actividad catecol-O-metil transferasa (COMT) en la eliminación de SAL, se inyectó esta molécula en el VTA de ratas junto o no al inhibidor de COMT entacapona, luego los niveles de SAL se midieron en el sobrenandante de homogeneizados de VTA o la vecina sustancia nigra. No se encontraron diferencias entre los niveles de SAL medidos de animales tratados o no con entacapona. El objetivo final fue detectar y cuantificar SAL en el cerebro de ratas naïve administradas con etanol sistémico. No se observó SAL en el núcleo accumbens o en el VTA de estas ratas. Tampoco se observó SAL, cuando se administró entacapona en el VTA paralelamente a la administración de etanol. En conclusión, se encontró que SAL es un agonista de μORs, que actúa in vitro a través de (S)-SAL y activa la vía de señalización de proteína Gi. Sin embargo, (S)-SAL no promovió una preferencia de lugar condicionada luego de ser infundido en el VTA, mientras que (R)-SAL si lo hizo. Estos resultados sugieren que hay blancos farmacológicos distintos de μORs para que (R)-SAL sea recompensante. No observamos SAL en el cerebro de animales administrados con etanol, incluso cuando un inhibidor de COMT se infundió en el VTA. SAL podría ser eliminado rápidamente del cerebro, sin embargo, los resultados muestran que SAL no se une al transportador de dopamina en concentraciones relevantes y el experimento de metabolización de SAL por COMT no fue concluyente. Para ser reforzante, SAL debería alcanzar concentraciones cerebrales activas en un microambiente, necesitando una metodología más precisa para monitorear su aparición local

The reinforcing effect of ethanol is a major contributor to ethanol dependence. The formation of acetaldehyde, the first ethanol metabolite, is required for ethanol to be reinforcing, by activating dopaminergic neurons in the ventral tegmental area (VTA). Whether acetaldehyde can bind to a receptor to be reinforcing is unknown, but it can condense with dopamine to form racemic salsolinol [(R) and (S)-SAL]. It has been proposed that SAL is the substance that exerts the reinforcing effect of ethanol consumption because SAL is a potent brain reinforcer when intracerebrally administered. Further, the levels of racemic SAL rise in the brain of rats after chronic ethanol administration. After an acute dose of ethanol, the levels of SAL in the brain reward system rise only if the metabolism of acetaldehyde is inhibited. The mechanism of SAL activity could be via μ-opioid receptors (μOR) since SAL displaces ligands from these receptors, but there is no evidence that SAL can directly activate μORs. This work aimed to determine whether SAL produced after an acute dose of ethanol activates the brain reward system of naïve rats via one of its enantiomers (either R or S) activation of μORs. Cell-based experiments showed that SAL activated μORs via Gi protein with no β-arrestin recruitment, and purified (S)-SAL was 50 times more potent than (R)-SAL. To support the experimental results we employed molecular dynamics simulations of (R) and (S)-SAL inside the binding pocket of the μOR. These simulations allowed us to explain that the enantiomeric specificity was caused by the interaction of the (S)-SAL chiral methyl group with the Y148 of the μOR, interaction that was not stable for (R)-SAL. The simulations showed that (S)-SAL, a small molecule compared to other opioid agonists, cannot interact with all the residues regarded as important for μOR activation, showing that (S)-SAL is a unique agonist of the receptor. Following, we determined whether (R) or (S)-SAL administration into the VTA of rats activate the brain reward system. The intra-VTA infusion of (R) and not of (S)-SAL induced a conditioned place preference in rats. The mechanism for this result may be different to μOR agonism since (S)-SAL did not induce an effect despite being a more potent agonist. Next, we intended to identify the reasons for the difficulty to detect SAL in the rat brain, despite being readily formed in vitro from acetaldehyde and dopamine at pH 7.4. The SAL activity at the dopamine transporter was explored using a cell-based assay, and we found that a millimolar SAL concentration was needed to be a ligand of the transporter, challenging the relevance of this uptake mechanism. To determine the effect of catechol-O-methyl transferase (COMT) in SAL elimination, SAL was injected intra-VTA of rats with or without the COMT inhibitor entacapone; then SAL levels were measured in VTA and substantia nigra homogenate supernatants. No differences were observed between the SAL levels measured from animals treated with, or without, entacapone. Finally, we aimed to detect and measure SAL in the brain of naïve rats administered with systemic ethanol. Rats were administered with ethanol, and brain homogenates assayed for SAL. No SAL was observed in either nucleus accumbens or VTA. When intra-VTA entacapone was administered concurrently with the ethanol administration, no SAL was observed either. In conclusion, SAL was found to be a μOR agonist, acting in vitro via (S)-SAL, activating Gi protein signaling. However, (S)-SAL was not active to induce a rat conditioned place preference after infused intra-VTA while (R)-SAL was able to. These results suggest that there is another target for (R)-SAL to be rewarding. We did not observe SAL in the brain of animals administered ethanol, even when a COMT inhibitor was infused intra-VTA. SAL may be rapidly eliminated, yet the results show that SAL is not a relevant ligand of the dopamine transporter and SAL metabolization by COMT experiment was inconclusive. To be reinforcing, SAL could reach proper levels in its receptor microenvironment, needing an accurate methodological approach to locally monitor its occurrence