Identificación de variantes en el promotor de RAET1E que originen cambios en sitios de unión a factores de transcripción, en tumores de pacientes con adenocarcinoma gástrico

Abstract

En Chile el cáncer gástrico es la primera causa de muerte por tumores malignos para ambos sexos, con alrededor de 3000 personas fallecidas al año, describiéndose las mayores tasas de mortalidad entre la VII y X región y las menores en las regiones extremas. Diversas investigaciones en el campo de la inmunidad anti-tumoral, han permitido evidenciar el rol del sistema inmune tanto en el control de células tumorales en etapas tempranas como en la evasión de la destrucción inmune favoreciendo el desarrollo del cáncer. Dentro de las células inmunes, las células Natural Killer (NK) tienen la capacidad de reconocer y eliminar células tumorales sin haber sido sensibilizadas previamente con el antígeno. Esto ocurre vía su receptor de activación NKG2D, cuya activación dependerá de la unión de sus ligandos expresados en la superficie de células tumorales. El reconocimiento y la unión del receptor NKG2D a sus ligandos (NKG2DLs) permite la activación de las células NK, conduciendo a la liberación de citoquinas o gránulos citolíticos y con ello la muerte de la célula tumoral que expresa uno o varios NKG2DLs en su membrana. Sin embargo, la generación de altos niveles de NKG2DLs en la superficie celular, así como la liberación de la molécula en forma soluble al ambiente tumoral, regulan negativamente la activación de las células NK afectando su funcionalidad, ya que inducen una disminución de NKG2D en la superficie de las células citolíticas, permitiendo con ello el crecimiento tumoral. Adicionalmente, los ligandos de NKG2D liberados compiten con las moléculas en la superficie de células tumorales, alejando a las células citolíticas de sus células blanco. En humanos se han descrito 2 familias de ligandos de NKG2D: las moléculas MIC y RAET1. Varios polimorfismos han sido descritos para estos ligandos, algunos de los cuales han sido asociados con un aumento del riesgo a desarrollar cáncer y podrían estar implicados como potenciales mecanismos de evasión inmune. Principalmente aquellos que generan cambios en residuos que disminuyen la afinidad por NKG2D o facilitan la liberación del ectodominio del NKG2DL. El gen RAET1E se caracteriza por presentar una identidad de secuencia menor al 43% con el resto de la familia de ligandos de NKG2D en humanos, lo que podría deberse a un rol distintivo de esta molécula. Su expresión en algunos tipos de cáncer se ha identificado como un predictor de mal pronóstico. Además, esta molécula se expresa en tumores de pacientes y líneas celulares de cáncer gástrico, mostrando un patrón de expresión heterogéneo. Llamativamente, estudios previos mostraron que la expresión de RAET1E en líneas celulares de CG, frente al estímulo de Helicobacter pylori, no fue revertida al bloquear MyD88, molécula corriente abajo de los TLR a diferencia de lo que ocurrió con los otros ligandos de NKG2D. Lo que podría deberse a que exista otra vía que regule su expresión. RAET1E, es el gen más variable dentro de los otros ligandos de la familia RAET1. La existencia de variaciones genéticas en regiones regulatorias que alteren la transcripción ha sido establecida durante mucho tiempo y tendrían un rol en las enfermedades humanas, entre ellas el cáncer. Estas variaciones podrían alterar sitios de unión a factores de transcripción y por tanto modificar su expresión, en particular, en condiciones de estrés como ocurre en un proceso tumorogénico. Se han descrito dos promotores para el gen RAET1E, siendo el 1 el más activo transcripcionalmente. Por lo tanto nos hemos propuesto como hipótesis, que “variantes en el promotor 1 de RAET1E en tumores de pacientes con adenocarcinoma gástrico modifican los sitios de unión para factores de transcripción”. Entonces, el objetivo general de este estudio fue “identificar variaciones en la región promotora de RAET1E que generaren cambios en esa región reguladora del gen, específicamente, alterando sitios de unión a factores de transcripción en pacientes con cáncer gástrico. Para ello, se analizó la región promotora de RAET1E en 50 muestras de adenocarcinoma gástrico a través de secuenciación de última generación. Y además, se evaluó in silico el efecto de estas variaciones. Identificamos 42 variantes de nucleótido único (SNV) en los tumores de pacientes con cáncer gástrico, 19 de ellas no reportadas previamente. No todos los SNVs generaron la modificación de sitios de unión para factores de transcripción (FT). Se determinó que 9 SNV alterarían sitios de unión para factores de transcripción. Entre los sitios afectados se generarían nuevos sitios de unión para los FTs: NKX 2-5, p53, AP-1, EVI1 y NFkB, mientras que se suprimirían sitios de unión para los FTs: MZF1, KLF3, c-Rel, SALL2, WT1 e IRF-2. Algunas de estas alteraciones de encontrarían presentes simultáneamente en un mismo paciente. En consecuencia, creemos que la alteración de estos sitios de unión podría generar cambios en la regulación del gen RAET1E al ser inducido por algunos de estos factores de transcripción, alterando la respuesta inmune mediada por este ligando y favoreciendo mecanismos de evasión en los pacientes con adenocarcinoma gástrico.

In Chile, gastric cancer (GC) is the leading cause of death due to malignant tumors in both sexes, with near 3,000 fatalities each year. The highest mortality rates have been described between VII and X regions while the lower rates are in the extreme regions. Several years of research in anti-tumour immunity have evidenced the role of the immune system, both in controlling tumor cells in early stages as in the evasion of immune-mediated destruction, promoting cancer development. Natural Killer (NK) cells have the ability to recognize and eliminate tumor cells without having previously been sensitized with the antigen. This occurs through the NKG2D activating receptor, whose activation depends on the union of their ligands expressed on the surface of tumor cells. The recognition and binding receptor NKG2D to its ligands (NKG2DLs) allows the activation of NK cells, leading to cytokine release or cytolytic granules and thereby death of the tumor cell expressing one or more NKG2DLs in their membrane. However, the expression of high levels of NKG2DLs on the cell surface and release of the molecule as soluble tumor environment, downregulate activation of NK cells affecting their functionality, since they induce a decrease NKG2D in cytolytic cell surface, thereby allowing tumor growth. Additionally, soluble NKG2D ligands compete with molecules on the surface of tumor cells, killer cells away to their target cells. 2 families of human NKG2D ligands have been described: the MIC and RAET1 molecules. Several polymorphisms have been described for these ligands, some of which have been associated with an increased risk to develop cancer and could be implicated as potential immune evasion mechanisms. Mainly those that generate changes that reduce waste affinity for NKG2D or facilitate the release of the ectodomain of NKG2DL. The RAET1E gene is characterized as the most divergent within the family of NKG2D ligands in humans, which could be due to a distinctive role of this molecule. Expression in some types of cancer has been identified as a predictor of poor prognosis. Furthermore, this molecule is expressed in tumors of patients and gastric cancer cell lines, showing a pattern of heterogeneous expression. Interestingly, previous studies showed that expression of RAET1E cell lines CG, in response to stimulus with Helicobacter pylori was not reversed by blocking MyD88, a molecule downstream of the TLR, unlike what happened with the other ligands of NKG2D. This could be explained by another pathway regulating its expression. The RAET1E gene is the most polymorphic among RAET1 ligands. The existence of genetic variations in regulatory regions that alter transcription has been established for a long time and has been shown to have a role in human diseases, including cancer. These variations could alter binding sites of transcription factors and thus alter its transcription and expression, in particular under stress as occurs in a tumorigenic process. Two promoters have been described for RAET1E gene and the first promoter (RAET1E_1) has been predicted as the most active transcriptionally. RAET1E_1 promoter variants in tumors of patients with gastric adenocarcinoma modify binding sites for transcription factors The aim of this study was to Identify variations in the promoter RAET1_1 that generate changes in its regulatory region and that may explain evasion of the immune response in tumors of patients with gastric cancer. Specifically, altering binding sites of transcription factors in patients with gastric cancer. For this purpose, the RAET1E promoter region was analyzed in fifty samples from patient with gastric adenocarcinoma through next generation sequencing. In addition, we analyzed the effect of these variations by computational approaches. We identified 42 single nucleotide variants (SNV) from tumors of patients with gastric cancer. Nineteen SNVs have not previously been reported. Only nine SNVs could alter binding sites for transcription factors. Transcription factors binding sites generated were: NKX 2-5, p53, AP-1, NFkB and EVI1 while transcription factor binding sites deleted were: MZF1, KLF3, c-Rel, SALL2, WT1 and IRF-2. Some of these alterations were simultaneously present in a same patient. Therefore, we believe that the alteration of these binding sites could lead to changes in the regulation of RAET1E gene when induced by some of these transcription factors, altering the immune response mediated by the ligand and favoring evasion mechanisms in patients with gastric adenocarcinoma.