Proteína inmunogénica de superficie de streptococcus agalactiae : estudio del mecanismo de su capacidad adyuvante inmunológico

Abstract

Streptococcus agalactiae también conocida como Streptococcus Grupo B (SGB), es una cocaccea Gram positiva, anaeróbica, facultativa y β-hemolítica capaz de colonizar el tracto genitourinario de un 15% a un 40% de mujeres embarazadas. Se asocia a la muerte fetal y parto prematuro. Así como es la principal causa de sepsis neonatal. El desarrollo de una vacuna contra SGB es prioritario según la OMS, hay vacunas de polisacáridos conjugadas que están en fase clínica II y existen otras vacunas en base a proteínas purificadas que se encuentran en fase clínica I y a nivel preclínico. Una de las proteínas que ha demostrado ser atractiva desde el punto de vista inmunológico como una alternativa para el desarrollo de una vacuna contra SGB, es la proteína inmunogénica de superficie conocida por sus siglas en inglés de SIP (surface immunogenic protein).En los 10 serotipos descritos a la fecha para SGB , esta proteína es altamente conservada en su secuencia aminoacídica y se ha ensayado como potencial inmunógeno para el desarrollo de una vacuna. La función biológica de esta proteína aún no ha sido descrita. En la Sección de Biotecnología del Instituto de Salud Pública de Chile se obtuvo la proteína SIP recombinante desde una cepa de SGB proveniente de un cuadro invasivo de sepsis y meningitis. Esta proteína se ha evaluado como prototipo de vacuna a nivel preclínico mediante inmunización oral y subcutánea, mostrándose que al ser inmunizada por la vía oral es capaz de conferir inmunidad protectora en un modelo murino. Además, esta proteína al ser inmunizada por la vía subcutánea sin la presencia de adyuvantes, confiere inmunidad protectora, que permite disminuir la colonización intravaginal por SGB, lo que nos hace suponer que esta proteína podría tener propiedades de adyuvante inmunológico para el desarrollo de vacunas. En esta tesis se obtuvo la proteína recombinante SIP desde E. coli BL21 (DE3) Codon plus mediante cromatografía de afinidad baja presión y su pureza se confirmó mediante cromatografía de exclusión molecular en HPLC. Se evaluó su capacidad de potenciar la respuesta inmune contra ova-albúmina (OVA) al inmunizar ratones de la cepa C57BL/6 con una mezcla de proteínas. La proteína rSIP formulada como adyuvante indujo mayor cantidad de anticuerpos anti-OVA que la formulación con OVA sola y con OVA más adyuvante ALUM. El estudio realizado en células dendríticas (DCs) permitió observar que rSIP indujo un cambio fenotípico en dichas células aumentando el marcador de superficie CD86/80 y DC 40 y MHCII. Respecto a los parámetros inmunológicos se observó que el sobrenadante de las DCs estimuladas con rSIP indujo un aumento de las citoquinas IL-10 y IL-12. La evaluación de la proteína rSIP como ligando de TLR muestra que es un agonista de TLR2 y TL4. Estudios preliminares de la estructura de la proteína rSIP permiten concluir que la estructura secundaria es mayoritariamente beta en su estado plegado, mientras que con 3,9 M de GdHCl está principalmente desplegada. Los resultados experimentales obtenidos en este trabajo de tesis nos permiten concluir que la proteína rSIP tiene el potencial adyuvante inmune

Streptococcus agalactiae also known as Streptococcus Group B (GBS) is a Gram positive, anaerobic, facultative and β-hemolytic cocaccea capable of colonizing the genitourinary tract from 15% to 40% of pregnant women. It is associated with fetal death and premature delivery, and also is the main cause of neonatal sepsis. Vaccine development against GBS is a priority according to the WHO. Conjugate polysaccharide vaccines are in clinical phase II and also there are vaccines based on purified proteins that are in clinical phase I and at the preclinical level. One of the proteins that has proven to be an immunologically attractive alternative to the development of a vaccine against GBS is the surface immunogenic protein known by its acronym SIP. In the 10 serotypes described to date for GBS this protein is highly conserved in the amino acid sequence and it has been tested as an immunogenic potential for the development of a vaccine. The biological function of this protein remains undescribed. The Biotechnology Section of the Public Health Institute of Chile has obtained the recombinant SIP protein from a strain of SGB from an invasive sepsis and meningitis. This protein has been evaluated as a prototype vaccine at the preclinical level by oral and subcutaneous immunization: The immunized by the oral route has shown to be able of conferring protective immunity in a murine model. In addition, when this protein was immunized by the subcutaneous route without the presence of adjuvants also confers protective immunity, which allows reducing intravaginal colonization by GBS. This makes us to assume that this protein could have immunological adjuvant properties for vaccine development. In this thesis, the SIP recombinant protein was obtained from E. coli BL21 (DE3) Codon plus by low pressure affinity chromatography and its purity was confirmed by HPLC molecule exclusion chromatography. The ability to enhance the immune response against ova was evaluated. Albumine (OVA) by immunizing mice of strain C57BL / 6 with a mixture of proteins. The rSIP protein formulated as an adjuvant induced a greater amount of anti-OVA antibodies than the formulation with OVA alone and with OVA plus adjuvant ALUM. The study carried out in dendritic cells (DCs) allowed us to observe that rSIP induced a phenotypic change in DCs, increasing the surface marker CD86 / 80 and DC 40 and MHC II. Respect to the immunological parameters it was observed that the supernatant of rSIP stimulated DCs induced an increase in the cytokines IL-10 and IL-12 secretion. The evaluation of the rSIP protein as a TLR ligand showed that it is an agonist of TLR2 and TL4. Preliminary structural evaluation of the rSIP protein allows to conclude a predominant beta structure in its folded state and that with 3.9 M of GdHCl it is mainly unfolded. The experimental results obtained in this thesis work allow us to conclude that the rSIP protein has the immune adjuvant potential