Generación de constructos para la sobreexpresión de GAD67 y GAD65 en células mesenquimales derivadas de médula ósea de ratón vivo in vitro

Abstract

Las Células Madres Mesenquimales (MSC) son células desdiferenciadas, residentes de tejidos adultos como médula ósea, tejido adiposo, tejido gingival, músculo esquelético y placenta, que son capaces de generar diversos tipos celulares de linaje mesenquimal, participando en la regeneración y mantención de la homeostasis tisular. Estudios recientes demuestran que, adicionalmente, las células MSC poseen capacidades inmunosupresoras, pudiendo ser de gran utilidad para el tratamiento de enfermedades inflamatorias autoinmunes. GABA es el mayor neurotransmisor inhibitorio del sistema nervioso central. Se ha comprobado la presencia de un sistema GABAérgico en células inmunes en donde ejerce una fuerte acción reguladora. In vitro, GABA disminuye la secreción de citoquinas por rnacrófagos y disminuye directamente la proliferación de células T. GABA es un eficiente agente inmunosupresor en diversos modelos experimentales de autoinmunidad, como diabetes de tipo 1, artritis reumatoide y esclerosis múltiple. La enzima sintetizadora de GABA, llamada GAD existe en dos isoformas, GAD65 y GAD67, cada una codificada por un gen distinto. La expresión de GAD65 y GAD67 en las células madres de ratón obtenidas de medula ósea (mBMMSCs) es escasa. Este laboratorio está interesado en obtener un producto celular mejorado más inmunosupresor para el estudio de tratamiento de enfermedades autoinmunes a nivel preclínico. La fabricación de constructos GAD67 y GAD65 en el Vector pcDNA3.3 permitiría la sobre-expresión de estas enzimas en células MSC, incrementando la liberación de GABA y, eventualmente, las capacidades inmunosupresoras de estas células. En la presente Tesis, se efectuó el clonamiento del marco de lectura de GAD67 y GAD65 humano en pcDNA3.3 TOPO y se implementó un protocolo de electroporación de células mesenquimales para la eficiente expresión de GAD en este tipo celular, evidenciado tanto por cartometría de flujo como por Western blot para GAD65. Nuestros resultados sientan base para estudiar el efecto de GABA en las funciones inmunomoduladoras por las células MSC sobre las células presentadoras de antígenos y linfocitos