EXPLORATION OF METFORMIN EFFECT OVER OXALIPLATIN ANTINEOPLASIC PROPERTIES IN MKN45, KATOIII AND HS746T GASTRIC CANCER CELL LINES IN VITRO AND OVER OXALIPLATIN INDUCED RAT PAINFUL SENSORY NEUROPATHY IN VIVO.

Abstract

Chemotherapy induced peripheral neuropathy (CIPN) is a pathological condition presented as a dose-limiting adverse effect of certain cancer treatments that affects long term quality of life by induction of transient or permanent disability. Chemotherapeutics induce axonal degeneration (AD), intraepidermal nerve fibers degeneration (IENFD) and glial activation at the central sensory circuits. There, chemotherapy induced hyperexcitability and ectopic discharges have been associated with sensory symptoms such as dysesthesia, paraesthesia and allodynia. Those CIPN symptoms often lead to an early suspension of chemotherapy that significantly reduces life expectancy. Unfortunately, there are no effective treatments for CIPN. This thesis explores proof of concepts to suggest the anti-diabetic drug metformin for further research as an experimental target to develop a potential treatment for CIPN. The effect of metformin was assayed in a model of oxaliplatin induced peripheral neuropathy (OIPN), which is characterized by oxaliplatin toxicity over dorsal root ganglia (DRG) sensory neurons. Considering that chemotherapy toxicity occurs in the context of an anticancer treatment, we first evaluated the role of metformin over the antineoplasic effect of oxaliplatin. To this goal, we determined cell survival of three different gastric cell lines (MKN45, HS746T and KatoIII cells) under several concentrations of oxaliplatin and metformin cotreatment. In all studied gastric cancer cell lines, we found that the significant reduction of cell survival induced by oxaliplatin was unaffected by metformin cotreatment. This result suggests that metformin does not interfere with the antineoplasic effect of oxaliplatin. Then, we explored the effect of metformin over oxaliplatin induced toxicity over sensory neurons at DRG and sensory function. To this goal, metformin was administered to rats undergoing oxaliplatin induced peripheral neuropathy (OIPN) and histological markers of degeneration along central and peripheral branches of DRG were determined after sensory function performance testing along the time of OIPN progression. Specifically, degeneration of peptidergic and non peptidergic neurons was explored along the peripheral and central branches of L4, L5 and L6 sensory neurons at IENF, sciatic nerve, dorsal root ganglia (soma) and spinal cord terminals. Additionally, activation of astrocytes was explored also at the spinal cord. In this context, metformin significantly inhibited oxaliplatin induced degeneration of IENF and activation of astrocytes in the spinal cord. Furthermore, oxaliplatin treatment induced a significant decrease threshold of the withdrawal response for mechanical stimulus and in the withdrawal latency response to heat stimulus. Additionally, oxaliplatin treatment also induced a significant increase in the withdrawal response duration to cold. Surprisingly, metformin cotreatment to rats treated with oxaliplatin maintained the sensory function performance at control levels. Altogether, these results suggest that metformin protects against OIPN. Finally, white blood cells, glycaemia and weight levels were periodically assayed to evaluate the effects of our treatments over relevant physiological variables. The levels of all these variables remained in physiological ranges under all the treatments along the study. Those results suggest that our experimental model is resolutive in a physiological framework in rats. Considering this, the administration regime, dosage and outcomes presented in this thesis could be potentially extrapolated to the clinical context. In conclusion, this group of findings provide a fundamental set of proof of concepts to a potential treatment against CIPN based on metformin administration. However, further research is needed to determine the cellular and molecular mechanism behind the ubiquitous protective effect of metformin against the toxicity of oxaliplatin over pain fibers and consequent maintenance of the sensory function in the context of OIPN. Additionally, large scale studies are needed to extrapolate these findings to the context of CIPN treatment in humans.

La neuropatía periférica inducida por quimioterapia (CIPN) es una patología que se presenta como un efecto adverso que limita la dosis de ciertos tratamientos anticáncer y afecta la calidad de vida a largo plazo por inducción de discapacidad permanente o transitoria. Las quimioterapias inducen principalmente degeneración axonal (AD), degeneración de fibras intraepidermales (IENFD) y activación glial en los circuitos sensoriales centrales. En ese contexto, hiperexcitabilidad y descargas ectópicas se han relacionado con síntomas sensoriales tales como diestesia, parestesia y alodinia. Estos síntomas a menudo llevan a una suspensión anticipada de la quimioterapia, lo cual reduce la expectativa de vida de manera significativa. Actualmente, no existen tratamientos efectivos contra la CIPN. Esta tesis explora pruebas de concepto para sugerir a la droga antidiabética metformina como un blanco experimental de investigaciones futuras, con el objetivo de desarrollar un potencial tratamiento contra la CIPN. El efecto de metformina fue estudiado en un modelo de neuropatía periférica inducida por oxaliplatino (OIPN), el cual se caracteriza por la toxicidad del oxaliplatino sobre las neuronas sensoriales del ganglio de la raíz dorsal (DRG). Considerando que la toxicidad de las quimioterapias ocurre en el contexto de un tratamiento anticáncer, evaluamos primero el rol de la metformina sobre el efecto antineoplásico del oxaliplatino. Para esto, determinamos supervivencia celular en tres líneas celulares diferentes de cáncer gástrico (células MKN45, HS746T y KatoIII), bajo diversas concentraciones de oxaliplatino y metformina en cotratamiento. En todas las líneas celulares estudiadas, encontramos que la reducción significativa de la supervivencia celular inducida por oxaliplatino no fue modificada por el cotratamiento con metformina. Este resultado sugiere que la metformina no interfiere con el efecto antineoplásico del oxaliplatino. Luego, exploramos el efecto de metformina sobre la toxicidad inducida por oxaliplatino en los DRG y la función sensorial. Para esto, se les administró metformina a ratas que estaban desarrollando neuropatía periférica inducida por oxaliplatino (OIPN) y se estudiaron marcadores histológicos de degeneración en las ramas centrales y periféricas del DRG después de evaluar el desempeño de la función sensitiva durante el tiempo de progresión de la OIPN. Específicamente, se exploró la degeneración de neuronas peptidérgicas y no peptidérgicas -a lo largo de las ramas centrales y periféricas de neuronas en L4, L5 y L6 -en las IENF, el nervio ciático, los ganglios de la raíz dorsal (soma) y los terminales en la médula espinal. Adicionalmente, se exploró la activación de los astrocitos en la médula espinal. En este contexto, metformina inhibió significativamente la degeneración de las IENF y la activación de los astrocitos en la médula espinal. Además, el tratamiento con oxaliplatino indujo una significativa disminución en el umbral de respuesta aversiva al estímulo táctil y en la latencia de respuesta aversiva frente a la estimulación por calor. Además, el tratamiento con oxaliplatino también indujo un significativo aumento de la duración de la respuesta aversiva al estímulo frío. Sorpresivamente, el cotratamiento con metformina a ratas tratadas con oxaliplatino mantuvo el desempeño de la función sensitiva en niveles control. Considerando todo esto, dichos resultados sugieren que la metformina protege de la OIPN. Finalmente, ensayamos periódicamente los niveles de glóbulos blancos, glicemia y peso, con el objetivo de evaluar los efectos de nuestros tratamientos sobre variables fisiológicas relevantes. Los niveles de todas estas variables permanecieron en rangos fisiológicos bajo todos los tratamientos y a lo largo de todo el estudio. Estos resultados sugieren que nuestro modelo experimental es resolutivo en un marco fisiológico en ratas. Considerando esto, el régimen de administración, los dosajes y los resultados presentados en esta tesis podrían potencialmente ser extrapolables a los del contexto clínico. En conclusión, este grupo de resultados proveen un set fundamental de pruebas de conceptos para un tratamiento potencial contra la CIPN basándose en la administración de la metformina. Sin embargo, se requiere de investigación adicional para determinar los mecanismos celulares y moleculares detrás del ubicuo efecto protector de la metformina contra la toxicidad del oxaliplatino sobre los circuitos del dolor y la consecuente mantención de la función sensitiva en el contexto de la OIPN. Adicionalmente, son necesarios estudios de gran escala para extrapolar estos descubrimientos al contexto del tratamiento de la CIPN en humanos.