Efecto de la hidroxilación del lípido A en Salmonella enterica serovar Enteritidis sobre la interacción con macrófagos murinos y la virulencia in vivo

Abstract

El lipopolisacárido (LPS) es un glicolípido complejo y componente mayoritario de la membrana externa de las bacterias Gram negativo, que no sólo desempeña una importante función estructural, sino que también constituye la primera interfase de interacción y adaptación al ambiente. En bacterias patógenas, el LPS actúa como un factor de virulencia preponderante. Su estructura, compuesta por el antígeno O, el core de oligosacáridos y el lípido A, es modificada en virtud de los diferentes microambientes que la bacteria enfrenta durante la infección en un hospedero. La presencia y remodelación del LPS son fundamentales en los procesos de adhesión y colonización de tejidos e invasión de células del hospedero, así como en la evasión y resistencia ante sus mecanismos de inmunidad. La mayoría de las modificaciones del LPS con un impacto conocido sobre la virulencia ocurren en el lípido A, dominio hidrofóbico que lo mantiene unido a la membrana y que también es su principal motivo bioactivo, actuando como un potente inductor de la respuesta inmune. Las variaciones en la composición del lípido A están orientadas a reducir la susceptibilidad bacteriana a agentes antimicrobianos y/o a modular la toxicidad de la molécula, alterando su reconocimiento como ligando del Receptor Tipo “Toll” 4. En Salmonella, LpxO es una dioxigenasa codificada por el gen lpxO, la cual cataliza la hidroxilación del lípido A. Mutantes de Salmonella Typhimurium con una deleción de lpxO manifiestan un fenotipo atenuado in vitro en macrófagos murinos e in vivo en ratones. Además, en este serovar la actividad catalítica de LpxO es inhibida por la proteína VisP, en cuya ausencia aumenta la hidroxilación del lípido A. La deleción del gen visP también produce una atenuación de S. Typhimurium. Por otro lado, en Klebsiella pneumoniae se ha descrito que la hidroxilación del lípido A media la resistencia a péptidos bactericidas y mitiga la respuesta inmune de macrófagos murinos. En Salmonella las propiedades inflamatorias del lípido A hidroxilado aún no han sido exploradas. El objetivo de esta tesis fue caracterizar la influencia de la hidroxilación del lípido A sobre la virulencia de Salmonella Enteritidis, una enterobacteria patógena Gram negativo de gran relevancia para la salud pública y la industria alimentaria, al ser actualmente el agente etiológico más prevalente de la salmonelosis transmitida por alimentos en el mundo. Para esto, se generaron mutantes de S. Enteritidis por deleción del gen visP o lpxO, siendo este último también sobreexpresado por complementación en trans. El lípido A purificado desde la cepa silvestre y las mutantes se caracterizó estructuralmente mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. También, se evaluó la interacción in vitro de cada cepa con macrófagos murinos, así como su capacidad para colonizar in vivo el intestino, tejidos linfoides subyacentes y órganos internos durante una infección simple en ratones. En la cepa silvestre de S. Enteritidis, se encontró que coexisten especies de lípido A hidroxilado y no hidroxilado en una distribución y proporción definida. Por su parte, la deleción de lpxO produjo sólo especies de lípido A carentes de hidroxilación, mientras que la sobreexpresión del gen produjo sólo especies de lípido A hidroxiladas. Tanto la deleción como la sobreexpresión de lpxO condujeron a una mayor fagocitosis, pero menor supervivencia intracelular de la bacteria en macrófagos murinos y provocaron que también sufriera graves defectos en la colonización intestinal y sistémica en ratones. La mutante que carece del gen lpxO indujo una mayor secreción de IL-6 por parte de macrófagos, indicio de que la modificación podría tener un efecto modulador sobre el potencial inmunogénico del lípido A como endotoxina. Por otro lado, la deleción del gen visP no causó ningún cambio en la hidroxilación del lípido A de S. Enteritidis, ni tampoco alteró la secreción de la citoquina pro-inflamatoria. El efecto que la hidroxilación tuvo sobre la respuesta inflamatoria de macrófagos es de particular interés, pues a la fecha es la primera y única evidencia que existe dentro del género Salmonella referida a que esta modificación podría influir sobre la inmunogenicidad del lípido A. En conjunto, los resultados obtenidos sugieren que debe existir un adecuado balance en la hidroxilación del lípido A de S. Enteritidis, tal como ocurre en cepa silvestre, para que la modificación contribuya a la virulencia de la bacteria.

The lipopolysaccharide (LPS) is a complex glycolipid and a major component of outer membrane of Gram negative bacteria. It fulfills an important structural function and also constitutes the first interfase for interaction and adaptation to the environment. In pathogenic bacteria, LPS acts as a preponderant virulence factor in pathogenesis. Its structure, composed by O antigen, core oligosaccharide and lipid A, is modified in response to different microenvironments faced by the bacterium during infection. The presence and remodeling of LPS is essential in several processes, such as adhesion and colonization of tissues, invasion of host cells, and evasion and resistance of host immunity. Most LPS modifications with a known impact on virulence occur in lipid A, a hydrophobic domain that keeps LPS linked to membrane and also corresponds to its main bioactive moiety, acting as a strong inducer of the immune response. Variations in lipid A composition are oriented to decrease the bacterial susceptibility to antimicrobial agents and/or to modulate the toxicity of this molecule, altering its recognition by Toll-like Receptor 4 (TLR4). In Salmonella, LpxO is a dioxygenase encoded by the lpxO gene, which catalyzes the hydroxylation of lipid A. Mutants of Salmonella Typhimurium with a deletion of lpxO show an attenuated phenotype in vitro in murine macrophages and in vivo in mice. Moreover, in this serovar the catalytic activity of LpxO is inhibited by VisP protein, whose absence results in increased lipid A hydroxylation. The deletion of visP also results in attenuation of S. Typhimurium. In addition, it has been described that lipid A hydroxylation in Klebsiella pneumoniae mediates the resistance to bactericide peptides and decreases the immune response of murine macrophages. In Salmonella, the inflamatory properties of hydroxylated lipid A have not yet been explored. The aim of this thesis was to characterize the influence that lipid A hydroxylation has on virulence of Salmonella Enteritidis, a Gram negative pathogenic enterobacterium relevant to public health and food industry, because it is the most prevalent etiologic agent of food-borne salmonellosis in the world. To this end, mutant strains of S. Enteritidis were constructed by deletion of visP or lpxO, being this latter gene also overexpressed by trans complementation. Lipid A purified from the wild-type strain and mutants was structurally characterized through MALDI-TOF mass spectrometry. The in vitro interaction of each strain with murine macrophages was also evaluated, as well as its ability to colonize in vivo the intestine, underlying lymphoid tissues and internal organs during murine infection. In the wild-type strain of S. Enteritidis we found that non-hydroxylated and hydroxylated lipid A species coexist in a defined distribution and proportion. The deletion of lpxO produced a lipid A lacking hydroxylation, whereas overexpression of this gene resulted in a fully hydroxylated lipid A. Both deletion and overexpression of lpxO led to increased phagocytosis, but lower intracellular survival of the bacterium in murine macrophages, and caused severe defects in the intestinal and systemic colonization in mice. The mutant lacking lpxO gene also induced high levels of IL-6 secretion by macrophages, suggesting that hydroxylation has a modulatory effect on the immunogenic potential of lipid A as endotoxin. In other hand, the deletion of visP gene did not cause any change in lipid A hydroxylation of S. Enteritidis, or alterations in the secretion of the pro-inflammatory cytokine. The effect of hydroxylation on the inflammatory response of murine macrophages is particularly interesting, because this is the first and only evidence within the Salmonella genus indicating that this modification could influence lipid A immunogenicity. Overall, the results obtained suggest that there must be an adequate balance in the hydroxylation of lipid A of S. Enteritidis, as in the case of the wild-type strain, so that this modification contributes to virulence of the bacterium.