PAPEL DE LA SUBUNIDAD β3 DE LA Na+/K+ ATPASA EN LA HOMEOSTASIS DE SODIO E HIPERTENSIÓN ARTERIAL

Abstract

Aldosterone (ALDO), through the activation of the mineralocorticoid receptor (MR) on epithelial cells from the distal nephron (DN), stimulates renal sodium reabsorption increasing circulatory blood volume and hence, blood pressure. Additionally, the increase of sodium reabsorption triggered by ALDO, induces the sodium potassium pump ATPase (NKA) activity at the basolateral membrane (BL) of tubular cells. However, the mechanisms involved have not yet been clarified. NKA pump is a heterodimer (α and β) protein, which mediates the transport of 3 Na+ ions to the extracellular medium, and 2 K+ ions to the intracellular medium in each cycle of activity. The αβ heterodimer assembly, which must reach the BL membrane of the epithelial cell, is required for fully NKA pump activation. The α subunit has the catalytic and transport activity and there are 4 isoforms with tissue specific expression. The α1 subunit is exclusively expressed in the kidney. On the other hand, the β subunit regulates cellular traffic and there are 4 isoforms. In kidney, only β1 and β3 subunit can be found. However, it is unknown which renal cells express β3. Previous studies carried out in Xenopus laevis oocytes demonstrated that the β3 subunit modulates the extracellular K+ dependent NKA pump activation. Additionally, studies carried out in our laboratory showed that ALDO inhibits the β3 subunit expression in both rodent kidney and cultured ND cells. The overexpression of the β3 subunit in main cells from the renal collecting tubule reduces about 60% of the NKA pump activity. The hypothesis of this doctoral thesis is that the activation of MR in the principal cells of the collecting ducts, inhibits the expression of the β3 subunit of the sodium potassium pump, modulating its activity. Adrenalectomized mice, treated or not with hormone replacement therapy and sham (control), were used to verify the in vivo hypothesis. Our results showed that adrenalectomy increased NKA β3 subunit mRNA abundance and protein expression by ~ 200% and ~ 70%, respectively, as compared to the control group. This change was observed only in the renal medulla but not in the renal cortex. The treatment did not affect the NKA α1 and β1 subunits in both renal medulla and cortex. In order to rule out a side effect due to the adrenal gland removal, MR was inhibited in vivo. In this case, 2 experimental groups were used, c57BL/6 mice were feed with pellet supplemented or not with spironolactone. Spironolactone treated animals, as with adrenalectomy, increased both mRNA and protein expression of the β3 subunit by 200% and 100%, respectively, and only in the renal medulla. The treatment did not affect the α1 and β1 subunit mRNA abundance or protein expression at the renal cortex or medulla, demonstrating specificity of the effect in terms of subunit and renal region. In vitro, the effect of the MR pharmacological blockade on the mpkCCD (c14) cell line was evaluated. A 50% increase in the β3 subunit expression was detected. The adenoviral overexpression of the NKA pump β3 subunit in tubular primary cells (IMCD) decreased the NKA pump activity by 60%. In conclusion, it was described for the first time that the MR controls only the β3 subunit expression in a tissue specific manner. The MR induced β3 subunit protein level increase would control the NKA pump activity.

Aldosterona (ALDO), a través de la activación del receptor de mineralocorticoides (MR) expresado en células epiteliales del nefrón distal (ND), estimula la reabsorción de sodio renal aumentando el volumen sanguíneo circulante y con ello la presión arterial. Adicionalmente el aumento de la reabsorción de sodio causado por ALDO induce la actividad de la bomba sodio potasio ATPasa (NKA), presente en la membrana basolateral (BL) de las células tubulares. Sin embargo, los mecanismos que median esta acción aún no se han aclarado. La bomba NKA es un heterodímero proteico (α y β), que media el transporte de 3 iones Na+ hacia el medio extracelular, y 2 iones K+ al medio intracelular en cada ciclo de actividad. La activación de la bomba NKA requiere el ensamblaje del heterodímero αβ, cuyo destino final es la membrana BL de la célula epitelial. La subunidad α posee la actividad catalítica y de transporte, y existen 4 isoformas con expresión diferencial en los tejidos, encontrándose la expresión exclusiva de α1 en el ND. Por otra parte, la subunidad β regularía el tráfico celular y existen 4 isoformas. Se ha descrito la expresión de β1 y de β3 en el riñón. Sin embargo, se desconoce cuáles son las células renales que expresan β3. Estudios previos realizados en oocitos de Xenopus laevis, demostraron que la subunidad β3 modula la activación de la bomba NKA por K+ extracelular. Adicionalmente, estudios realizados en nuestro laboratorio demostraron que la expresión de la subunidad β3 es inhibida por ALDO en riñón de roedores y en células del ND en cultivo. La sobre-expresión de la subunidad β3 en células principales del túbulo colector renal reduce en aproximadamente 60% la actividad de la bomba NKA La hipótesis de esta tesis doctoral es que la activación del receptor de mineralocorticoides en las células principales de túbulo colector, inhibe la expresión de la subunidad β3 de la bomba sodio potasio ATPasa, modulando su actividad. Primero, para verificar la hipótesis in vivo se utilizaron ratones adrenalectomizados, tratados con terapia de sustitución hormonal y sham (control). Nuestros resultados obtenidos dan cuenta que la adrenalectomía incrementó la abundancia del ARNm y la expresión proteica de la subunidad β3 de la NKA, en un ~200% y un ~70%, respectivamente, en comparación al grupo control. Este cambio se observó solamente en médula renal y no en corteza renal. El tratamiento no afectó las subunidades α1 y β1 tanto de médula como de corteza renal. Con la finalidad de descartar un efecto secundario de la remoción de la glándula adrenal, se inhibió in vivo el MR. En este caso se utilizaron 2 grupos experimentales, ratones C57BL/6 alimentados con pella suplementada con espironolactona y pella sin espironolactona. Los animales tratados con espironolactona, al igual que con la adrenalectomía, incrementaron tanto el ARNm y la expresión proteica de la subunidad β3 en un 200% y un 100%, respectivamente, y solo en médula renal. El tratamiento no afectó la abundancia del ARNm ni la expresión proteica de las subunidades α1 y β1 en corteza o médula renal. Estos resultados muestran que el efecto la activación de MR es específico en cuanto a subunidad de la NKA y la región renal en donde se expresa. In vitro, se evaluó el efecto del bloqueo farmacológico del MR en la línea celular mpkCCD(c14). Se detectó que la subunidad β3 incrementó su expresión en un 50%. La sobreexpresión adenoviral de la subunidad β3 de la bomba NKA en cultivo primario de células principales de túbulo colector, disminuyó la actividad de la NKA en un 60%. En conclusión, se describe por primera vez que el MR controla sólo expresión de la subunidad β3, de manera tejido específico. El aumento de los niveles proteicos de la subunidad β3 regulada por el MR controlaría la actividad de la bomba NKA.