Role of A3 adenosine receptor as a mediator of the chemoresistant and invasive properties of glioblastoma stem-like cells

Abstract

Glioblastoma Multiforme (GBM) is the deadliest primary brain tumor worldwide. This type of neoplasia is highly chemoresistant and infiltrative, characteristics that favors tumor reoccurrence after treatment. Has been postulated that a sub-population of cells called "Glioblastoma Stem-like Cells" (GSCs) could be responsible for the generation and maintenance of these characteristics. However, the mechanisms that regulate these properties in GSCs are not fully understood and their discovery could help towards the development of new treatments. Studies in our laboratory have shown that the Mrp1 transporter could be responsible for the multiple drug resistance (MDR) phenomenon observed in differentiated GBM cells (non-GSCs). Nevertheless, the expression and activity profiles of the Mrp1 transporter in GSCs remain uncharacterized. To infiltrate the cerebral parenchyma, GBM cells must develop the Epithelial- Mesenchymal transition (EMT) phenomenon with the purpose of acquiring a more invasive phenotype, which is enhanced under conditions of hypoxia. However, it is unknown whether EMT is able to regulate the migration and invasiveness capacity of GSCs, especially under hypoxic conditions. Has been reported that the bioavailability of extracellular adenosine is increased in the tumor microenvironment, which is higher under hypoxic conditions, favoring chemoresistance and cell invasion through the activation of its A3 receptor (A3AR). To date, the ecto-5'-nucleotidase (CD73) and Prostatic Acid Phosphatase (PAP) have been described as the limiting enzymes for extracellular adenosine production in GBM. Previously in our laboratory proved that CD73 activity is required for maintaining the MDR phenotype in differentiated GBM cells and that the use of MRS1220, a selective A3AR antagonist, can reverse the refractoriness of GBM cells to chemotherapy. On the other hand, extracellular adenosine generated by CD73, promotes invasiveness in different neoplasms. In GBM, has been proposed that the activation of A3AR under normoxia favors cell invasion. Despite this, no previous studies have described the effect of the extracellular adenosine axis and its A3 receptor on the MDR phenomenon and invasion process in GSCs, even under hypoxic conditions, a condition that homologates the oxygen (O2) supply in the tumor microenvironment. Based on this background, we proposed that the chemoresistant and invasive capacities of GSCs is mediated by A3 Adenosine Receptor signaling. To corroborate our hypothesis, the effect of extracellular adenosine signaling through the A3 receptor on Mrp1 mediated chemoresistance (stage 1) and invasive capacity (stage 2) of GSCs was evaluated in two stages using in vitro, ex vivo, and in vivo assays. Our results showed increased extracellular adenosine production and expression of Mrp1 transporter in GSCs than its respective differentiated cells. Treatment with MRS1220 decreased the expression and activity of the Mrp1, chemosensitizing both in vitro and in vivo, GSCs to treatment with vincristine (Mrp1 drug substrate). Mass sequencing of transcripts indicated that the PI3K/Akt and MEK/Erk pathways could be activated by A3AR. On the other hand, under hypoxic conditions the concentration of extracellular adenosine increased in GSCs due to greater expression of CD73 and PAP. Treatment with MRS1220 decreased cell migration and invasion, both in vitro and ex vivo, in GSCs during hypoxia. By mass sequencing of transcripts, a decrease in the expression of 15 transcripts related to migration and invasion processes was identified in the GSCs treated with MRS1220. In addition, the protein expression of EMT markers decreased under treatment with MRS1220 in the GSCs under conditions of hypoxia. Our results allow us to conclude that GSCs have a higher production of extracellular adenosine which is increased under hypoxic conditions, due to increased expression and activity of CD73 and PAP ectonucleotidases. The generated extracellular adenosine regulates Mrp1 transporter expression and activity through the activation of its low affinity receptor A3. Thus, when using a selective A3AR antagonist, GSCs showed increased chemosensitivity to treatment with a Mrp1 drug substrate. Activation of A3AR can also regulate the EMT phenomenon and, therefore, enhance the cell migration and invasion in GSCs. We propose the use of selective A3AR antagonists in conjunction with a Mrp1 drug substrate, as possible co-adjuvants for the treatment of GBM patients, thus reducing recurrence rates attributed to extreme chemoresistance and the formation of satellite tumors in healthy tissue.

El Glioblastoma Multiforme (GBM) es el tumor cerebral primario más mortal a nivel mundial. Este tipo de neoplasia es altamente quimioresistente e infiltrativa, características que le permiten realizar recidivas al poco tiempo después de su tratamiento. Se ha postulado que una sub-población de células denominadas como “Glioblastoma Stem-like Cells” (GSCs) serian las responsables de la generación y mantención de estas características. No obstante, no están del todo claro los mecanismos que regulan estas propiedades en las GSCs, por lo cual su comprensión abriría la posibilidad de generar nuevas terapias. Trabajos en nuestro laboratorio han demostrado que el transportador Mrp1 sería el responsable del fenómeno de resistencia a multidrogas (MDR) observado en células diferenciadas (no GSCs) de GBM. Sin embargo, el perfil de expresión y actividad de este transportador en las GSCs permanece aún sin caracterizar. Para infiltrar el parénquima cerebral, las células del GBM deben desarrollar el fenómeno de transición Epitelio-Mesenquimal (EMT) con la finalidad de adquirir un fenotipo más invasivo, el cual es potenciado bajo condiciones de hipoxia. Sin embargo, se desconoce si la EMT es capaz de regular la capacidad de migración e invasión de las GSCs, más aún bajo condiciones de hipoxia. Se ha reportado que la biodisponibilidad de adenosina extracelular se ve incrementada en el microambiente tumoral, siendo ésta aún mayor bajo condiciones de hipoxia, favoreciendo procesos de quimioresistencia e invasión celular a través de la activación su receptor A3 (A3AR). A la fecha, se han descrito a CD73 y fosfatasa ácida prostática (PAP), como las enzimas limitantes en la xv producción de adenosina extracelular en el GBM. Previamente en nuestro laboratorio se demostró que la actividad de CD73 es necesaria para la mantención del fenotipo de MDR en células diferenciadas de GBM, y que la utilización MRS1220, un antagonista selectivo del A3AR, es capaz de revertir la refractoriedad de estas células a la quimioterapia. Por otra parte, la adenosina extracelular generada por CD73, es capaz de promover procesos de invasividad en diferentes neoplasias. En el caso de GBM se ha propuesto que la activación del A3AR bajo condiciones de normoxia favorecería la invasión celular. Pese a esto, en la actualidad no existen trabajos que describan el efecto del eje de adenosina extracelular y de su receptor A3 en el fenómeno de MDR y en el proceso de invasión en las GSCs, más aún bajo condiciones de hipoxia, situación que buscaría homologar el suministro de oxigeno (O2) presente en el microambiente tumoral. Con base en estos antecedentes, postulamos que la capacidad quimioresistente e invasiva de las GSCs es mediada por la señalización del receptor de adenosina A3. Para corroborar nuestra hipótesis se evaluó en dos etapas el efecto de la señalización de adenosina extracelular a través de su receptor A3 sobre la capacidad quimioresistente mediada por Mrp1 (etapa 1), y sobre la capacidad invasiva (etapa 2) de las GSCs, utilizando ensayos in vitro, ex vivo, e in vivo. Nuestros resultados muestran una mayor generación de adenosina y expresión del transportador Mrp1 en las GSCs que en sus respectivas células diferenciadas. El tratamiento con MRS1220 disminuyó la expresión y actividad de Mrp1, quimiosensibilizando tanto in vitro como in vivo, a las GSCs al tratamiento con vincristina (droga sustrato de Mrp1). La secuenciación masiva de transcritos indicó que las vías PI3K/Akt y MEK/Erk estarían siendo activadas por el A3AR. Por otro lado, bajo condiciones de hipoxia la concentración de adenosina incrementó en las GSCs debido a una mayor expresión de CD73 y PAP. El tratamiento con MRS1220 disminuyó el proceso de migración e invasión celular, tanto in vitro como ex vivo, en las GSCs bajo hipoxia. Por secuenciación masiva de transcritos se identificó una disminución en la expresión de 15 transcritos relacionados con procesos de migración e invasión en las GSCs tratadas con MRS1220. Además, la expresión proteica de marcadores de EMT disminuyó bajo el tratamiento con MRS1220 en las GSCs en condiciones de hipoxia. Nuestros resultados nos permiten concluir que las GSCs tienen una mayor capacidad de producción de adenosina extracelular y que ésta se ve incrementada bajo condiciones de hipoxia, debido a una mayor expresión y actividad de las ectonucleotidasas CD73 y PAP. La adenosina extracelular generada es capaz de regular la expresión y actividad del transportador Mrp1 a través de la activación de su receptor A3. De esta forma, al utilizar un antagonista selectivo del A3AR, las GSCs mostraron una mayor quimiosensibilidad al tratamiento con una droga sustrato de Mrp1. La activación del A3AR además es capaz de regular el fenómeno de EMT, y de esta forma potenciar la migración e invasión de las GSCs. Proponemos el uso de antagonistas selectivos del A3AR en conjunto a una droga sustrato de Mrp1, como posibles co-adyuvantes para el tratamiento de pacientes con GBM, disminuyendo de esta manera las tasas de reincidencias atribuidas a la extrema quimioresistencia y a la formación de tumores satélites en el tejido sano.