Rol del receptor de lipoproteínas de alta densidad, SR-BI, en el cierre del tubo neural: evidencias a partir de un ratón deficente en SR-BI y estudio de la participación de este receptor en la anencefalia humana

Abstract

El receptor Scavenger Class B type I (SR-BI) une lipoproteínas de alta densidad (HDL) y media el transporte bidireccional de lípidos entre la lipoproteína y la célula, incluyendo colesterol y vitamina E. Alrededor de la mitad de los embriones deficientes de SR-BI (SR-BI -/-), presentan un defecto en el cierre del tubo neural (NTD) anterior en el día 9,5 de desarrollo (E9,5), provocando el crecimiento del cerebro expuesto al líquido amniótico, su destrucción durante el parto y la muerte perinatal. A pesar de este fenotipo embrionario, la proteína de SR-BI no se localiza en el embrión propiamente tal sino en las células trofoblásticas que rodean el sitio de implantación y que, entre otras funciones, captan nutrientes del ambiente materno. SR-BI se expresa en células del trofoblasto humano de primer trimestre, pero se desconoce si existe una relación entre defectos en este receptor y la anencefalia (resultado de NTD a nivel cefálico) en seres humanos. En esta tesis, se evaluó el rol de SR-BI en la captación embrionaria de vitamina E, un nutriente transportado en HDL, y la importancia de este proceso para el cierre del tubo neural. Utilizando técnicas de secuenciación masiva y análisis bioinformáticos se exploraron posibles mecanismos moleculares para explicar las diferencias fenotípicas observadas en los embriones SR-BI -/-. Por último, se evaluó la asociación entre defectos en SR-BI y la presencia de NTD en humanos. Uno de los resultados más destacables obtenidos en esta tesis fue que los embriones SR-BI -/- obtenidos de cruzas entre ratones heterocigotos, en comparación a los embriones SR-BI +/+, presentan niveles muy reducidos de vitamina E, asociados a un incremento en los niveles de ROS y que la suplementación materna con una dieta enriquecida en vitamina E previno casi completamente los NTD en los embriones SR-BI -/-, con una disminución en los niveles de ROS en estos embriones. Para explorar los mecanismos moleculares y la penetrancia parcial de NTD en los embriones SR-BI -/-, se cuantificaron los niveles de expresión global mediante secuenciación masiva en tres grupos de embriones: SR-BI +/+ y SR-BI -/- con y sin NTD. Se identificaron perfiles transcripcionales divergentes entre los embriones SR-BI -/- que completan el cierre del tubo neural y aquellos que no lo completan. Los embriones SR-BI -/- con NTD presentan un incremento de la expresión de genes involucrados en la captación de nutrientes, mientras que los embriones SR-BI -/- que no presentan NTD muestran una mayor expresión de genes relacionados con el desarrollo neural. Con estos datos, se lograron identificar genes específicos que podrían modular el fenotipo de los embriones SR-BI -/- y cuya expresión es regulada por el tratamiento materno con vitamina E. Además, utilizando análisis de redes de regulación génica, se aisló una red de regulación transcripcional con una posible función en el cierre del tubo neural en los embriones SR-BI -/-, en la cual el receptor de andrógenos sería un regulador maestro. Con respecto a la posible participación de SR-BI en el desarrollo embrionario y la anencefalia en humanos, se estudió si existían defectos en los niveles totales o la localización de SR-BI, utilizando Western blot e inmunohistoquímica, respectivamente en placentas de término de embarazos cursando con anencefalia. No se observaron alteraciones en la abundancia de la proteína o su localización en placentas de niños con anencefalia. Por último, se secuenciaron los exones del gen que codifica para SR-BI (SCARB1) en muestras de recién nacidos anencefálicos de un banco de ADN, para evaluar la asociación de variantes en el gen que codifica para SR-BI con esta malformación. Se identificó una variante rara (Ser129Leu) con una frecuencia mayor en niños con anencefalia, en comparación a la población adulta sana. En conjunto, los resultados obtenidos en ratones sugieren que la deficiencia de SR-BI afecta la apropiada captación de vitamina E desde el ambiente materno durante el cierre del tubo neural, modificando el patrón transcripcional embrionario y potencialmente aumentando el riesgo de NTD. Además, estos estudios demuestran la presencia de SR-BI en placenta humana y sugieren que algunas variantes del gen SCARB1 pudieran asociarse a un mayor riesgo de anencefalia. En conjunto, los resultados de esta tesis plantean que SR-BI participa en la provisión de vitamina E durante el cierre del tubo neural en mamíferos, y sugieren que adecuar la ingesta de vitamina E en mujeres en edad fértil podría ser una estrategia atractiva para prevenir los NTD en humanos.

The Scavenger Receptor Class B Type I (SR-BI) binds high-density lipoproteins (HDL) and mediates bidirectional transport of lipids, such as cholesterol and vitamin E. Around half of SR-BI KO embryos show anterior neural tube defects (NTD) at embryonic day 9.5 (E9.5), leading to the exposure of the brain to the amniotic fluid and perinatal death. Despite this embryonic phenotype, SR-BI is not located in the embryo proper, but in the trophoblast cells surrounding the implantation site that facilitate maternal-fetal nutrient transport. Although SR-BI is expressed in human trophoblast cells during the first trimester, it is unknown whether defects in this receptor are associated with NTD in humans. In this thesis, the role of SR-BI in embryonic uptake of vitamin E and its importance for neural tube closure were evaluated. The molecular basis for the phenotypic differences in SR-BI KO embryos were explored using massively parallel sequencing and bioinformatics. Finally, the relationship between defects in SR-BI and NTD in humans was evaluated. There was a striking reduction in the levels of vitamin E in SR-BI KO embryos compared to wild-type (WT) embryos from heterozygous intercrosses. This vitamin E deficiency was associated with an increase in the levels of reactive oxygen species. Furthermore, maternal supplementation with vitamin E prevented NTD in SR-BI KO embryos almost completely. Using RNA sequencing, divergent transcriptional profiles were detected in SR-BI KO embryos with or without NTD. Those with NTD show increased expression of genes involved in nutrient transport, whereas SR-BI KO embryos without NTD have higher mRNA levels of genes involved in neural development. Using gene regulatory network analyses, a new regulatory circuit was identified, implicating the androgen receptor in neural tube closure. In human placental samples, the association between alterations in the levels or localization of SR-BI was studied. There were no changes in the protein abundance or localization of SR-BI in placentae from anencephalic neonates. Lastly, the association between genetic variation in the SR-BI gene and anencephaly was assessed in samples from a neonate cohort. There was an association between the presence of a rare variant (Ser129Leu) and the presence of anencephaly in this cohort. In summary, these results indicate that SR-BI participates in the provision of vitamin E to the embryo, influencing the transcriptional profile and modulating neural tube closure in mammals. These suggest that adequate vitamin E consumption could be an attractive strategy for the prevention of NTD.