Identificación y caracterización de residuos esenciales en la vía de migración de sustrato del transportador de ácido ascórbico SVCT2.

Abstract

Los humanos son incapaces de sintetizar vitamina C y por lo tanto deben obtenerla de la dieta. La concentración intracelular de vitamina C depende de la expresión y función de los transportadores de esta vitamina en la membrana plasmática de las células. El ácido ascórbico, la forma reducida de la vitamina C, es transportado por los co-transportadores de sodio-ascorbato, SVCTs. Se han caracterizado funcionalmente en humano dos transportadores, SVCT1 y SVCT2. Ambas proteínas, se clasifican dentro de la superfamilia de transportadores de nucleobases y cationes tipo 2 (NAT/NCS-2) de la cual hasta la fecha sólo dos miembros han sido cristalizados. Si bien se conoce en detalle los aspectos funcionales asociados a la captación de ácido ascórbico mediado por SVCT2, existe poca información acerca de su estructura y los residuos claves para su función. En este trabajo, presentamos un modelo tridimensional de SVCT2 basado en el transportador de uracilo acoplado a protones (UraA) que pertenece a la superfamilia NAT/NCS-2 cuya estructura y función se conoce. Mediante el análisis completo de mutagénesis sitio dirigida y de barrido de alanina de los segmentos transmembrana 3 y 10 (TM3, TM10) de SVCT2, se identificaron y caracterizaron en el segmento TM3 los residuos Gln-166, Ala-167, Ser-168 y Ala-169, y en el segmento TM10 los residuos Asn-436, Asn-444, Ile-450 y Thr-451, indicando que son esenciales para el transporte de ácido ascórbico y que estarían formando parte del canal central. Además, se logró identificar los residuos que formarían parte de una putativa hoja beta, localizada entre los segmentos TM3 y TM10, siendo esencial para la estructura tridimensional de SVCT2. El análisis exhaustivo de la estructura-función del bolsillo de unión a sustrato nos permitió generar una estructura tridimensional del transportador de SVCT2 de 14 segmentos transmembrana, donde TM3 y TM10, son fundamentales para la función y la estructura del transportador.

Humans are unable to synthesize vitamin C and therefore must obtain it from the diet. The intracellular vitamin C concentration depends on the expression and function of vitamin C transporters in the plasma membrane of cells. Ascorbic acid, the reduced form of vitamin C, is transported by sodium-ascorbate co-transporters, SVCTs. Two of them, SVCT1 and SVCT2, have been functionally characterized in humans. These proteins, are classified within NAT/NCS-2 superfamily (Nucleobase/ascorbate and cations type 2 transporters) of which only two members have been crystallized to date. Although the functional aspects associated with the uptake of ascorbic acid mediated by SVCT2 are known in detail, there is little information about its structure and the key residues for its function. In this work, we present a three-dimensional SVCT2 model based on the proton-coupled uracil transporter (UraA) that belongs to the NAT/NCS-2 superfamily whose structure and function is known. Through the complete analysis of site-directed mutagenesis and alanine scanning of the transmembrane segments 3 and 10 (TM3, TM10) of SVCT2, residues Gln-166, Ala-167, Ala-169 and Ser-168 were identified and characterized in the TM3 segment and Asn-436, Asn-444, Ile-450 and Thr-451 in TM10, indicating that they are essential for ascorbic acid transport and that they could be forming part of the central channel. In addition, it was possible to identify residues that could be part of a putative beta sheet, located between the TM3 and TM10 segments, being essential for the three-dimensional structure of SVCT2. The exhaustive structural and functional analysis of the substrate binding pocket allowed us to generate a three-dimensional structure of the 14-transmembrane segment SVCT2 transporter, where TM3 and TM10 are fundamental for the function and structure of the transporter.