Mechanism of cell death induced by the action of visible light and flavinic photosensitizers in solution and incorporated in silica nanoparticles for photodynamic therapy.

Abstract

In this thesis, I had studied the mechanisms of cell death induced by the action of visible light and flavin photosensitizers in both human HL-60 leukemia cells, and HeLa human cervix epithelioid carcinoma cells, which grow attached to the substrate forming a monolayer. It is demonstrated that the combined action of visible light and flavin photosensitizers induce apoptosis-programmed and also autophagy cell death, using transmission electron microscopy, flow cytometry, fluorescence microscopy through lysosomal markers, together with autophagy inhibitors. These mechanisms have the advantage of not causing inflammation which decreases the side effects of therapy. To improve photostability and incorporation of riboflavin, the possibility of incorporating it into nanoparticles was studied. With the aim to incorporate the photosensitizer in a stable form to nanoparticles, a tetrasilylated derivative of riboflavin was prepared. The compound retained the photophysical and photochemical properties of RF. In a first step, magnetic nanoparticles were synthesized and characterized by transmission electron microscopy. The photosensitizer was incorporated by reacting the tetrasilylated compound with a layer of silica with which the magnetic nanoparticle was coated. Silicon nanoparticles containing the silylated riboflavin compound were prepared. The nanocomposites were photochemically active and induced photo-toxic effects in HL-60 cells when irradiated in vitro with blue light.

En esta tesis, he estudiado los mecanismos de muerte celular inducidos por acción de la luz visible y fotosensibilizadores flavínicos en células humanas de leucemia HL-60, y en células de carcinoma de útero HeLa, que crecen adheridas al sustrato formando una monocapa. Se demostró que la acción conjunta de la luz visible y fotosensibilizadores flavínicos induce muerte celular programada por apoptosis y también por autofagia, utilizando microscopía electrónica de transmisión, citometría de flujo, microscopía de fluorescencia utilizando marcadores de lisosomas, en conjunto con inhibidores de autofagia. Estos mecanismos presentan la ventaja de no provocar inflamación lo que disminuye los efectos secundarios de una terapia. Con el objetivo de mejorar la fotoestabilidad y la incorporación de la riboflavina se estudió la posibilidad de incorporarla a nanopartículas. Para poder incorporar el fotosensibilizador en forma estable se preparó un derivado tetrasililado de la riboflavina, el que mantiene sus propiedades fotofísicas, fotoquímicas. En una primera etapa se sintetizó nanopartículas magnéticas que fueron caracterizadas por microscopía electrónica de transmisión. El fotosensibilizador fue incorporado haciendo reaccionar el compuesto tetrasililado con una capa de sílica con la que se recubrió la nanopartícula magnética. Se sintetizó nanopartículas de silicio, a las que se unió covalentemente el compuesto sililado de riboflavina. Las nanopartículas resultaron fotoactivas y producen efectos foto-tóxicos en células HL-60 cuando se irradian con luz azul in-vitro.