Efecto del albumina y su modificación oxidativa sobre la actividad de lisozima y de la toxina hemolítica st ii

Abstract

En humanos, la albúmina de suero (HSA) es la proteína más abundante del plasma alcanzando concentraciones de 600 ?M. HSA puede unir una amplia gama de compuestos naturales y sintéticos. Su abundancia hace a la albumina el candidato más adecuado para estudios sobre el efecto de la presencia de altas concentraciones de un soluto macromolecular en la actividadde proteínas En el presente trabajo se comunican los resultados relacionados con el efecto de HSA sobre la actividad de dos proteínas diferentes.La lisozima es una enzima bien conocida, ampliamente estudiada desde que fue descrita por primera vez por Alexander Fleming. Esta enzima es reconocida por sus "propiedades antibacterianas", las que derivan de la capacidad de esta proteína de dañar las paredes celulares bacterianas al catalizar la hidrólisis de uniones beta-1,4 entre residuos de ácido Nacetilmurámico y N-acetil-D-glucosamina en peptidoglicanos presentes en lapared celular. La lisozima se puede encontrar en una serie de fluidos biológicos como saliva, lágrimas, plasma y leche. Últimamente, esta enzima harecuperado mucha atención ya que ha sido propuesta como un marcador útil para el diagnóstico de una serie de enfermedades infecciosas, procesos inflamatorios y algunos tipos de cáncer.El efecto de la adición de HSA sobre la velocidad de hidrólisis del sustrato sintético 4-metilumbeliferil-?-D-N-N'-N" triacetilquitotriosido ((NAG) 3-MUF) catalizada por lisozima de clara de huevo de gallina fue medida en solución acuosa (buffer citrato 50 mM, pH 5,2 a 37 °C). La presencia de HSA produce una disminución en la velocidad del proceso. La reacción sigue unmecanismo de Michaelis-Menten bajo todas las condiciones estudiadas. La constante de velocidad catalítica disminuye 1 O veces cuando se aumenta la concentración de albúmina, mientras que la constante de Michaelis permanece casi constante en el intervalo de concentraciones empleado. Experimentos de ultra-centrifugación indican que la razón principal de la variación observada en el comportamiento cinético está relacionada con la existencia de una interacciónHSA-lisozima. lnteresantemente, la dependencia de la constante de velocidadcatalítica con la concentración de albúmina es paralela a la disminución de la concentración de la enzima libre. Estos resultados se han interpretado entérminos de la presencia de de dos poblaciones de enzima en el sistema, esdecir, enzima inactiva asociada a HSA y la enzima libre que reacciona tal ycomo lo haría en ausencia de HSA. Otros factores tales como la asociación desustrato a albúmina o efectos de volumen excluido debido a la presencia dealbúmina fueron descartados.Modelos teóricos de la estructura del complejo HSA-Iisozima muestran que los residuos Glu35 y Asp52 ubicados en el sito activo de la lisozima se orientan hacia la superficie de la HSA. Esta conformación inactiva a las moléculas unidas a HSA.St II pertenece a la familia de toxinas marinas con alta actividad hemolítica debido a su capacidad de formar canales en bicapas naturales y sintéticas. Esta actividad ha sido probada bajo una variedad de condiciones y se puede concluir que la función de la toxina es extremadamente sensible a sumodificación y las características del blanco en la membrana. Así, la capacidadformadora de poros de la toxina puede ser regulada por fuerza iónica, pH,composición lipídica de la membrana, mutaciones, asociación de surfactantes,oxidación parcial, etc. A pesar del gran número de trabajos destinados aestablecer la relación entre las condiciones experimentales y la actividad de la toxina, no se han realizado estudios sobre el efecto de proteínas sobre la actividad de la toxina. Este aspecto es particularmente importante, ya que la presencia de proteínas puede influir tanto en las características de la membrana y la capacidad de la toxina de unirse a la bicapa y lograr la conformación precisa para formar los poros necesarios para desencadenar la lisis provocada por el choque osmótico. Además, la acción hemolítica de la toxina en los organismos vivos debe tener lugar en presencia de grandes cantidades deproteínas, en particular, albúminas.Los datos del efecto de la HSA en la capacidad de St para generar porosen glóbulos rojos y en membranas modelo compuestas de dipalmitoilfosfatidilcolina y esfingomielina mostraron resultados interesantes. Tanto para glóbulos rojos y liposomas, el tiempo requerido para la formación de agregados funcionales de St II en la superficie de las membranas aumenta en presencia de HSA. La eficiencia de St II de permear liposomas/lisis de glóbulos rojos se ve afectada de forma diferente por la presencia de HSA. La fracción deliposomas permeados por St II disminuye en presencia de HSA. Por otro lado,la eficiencia del proceso de ruptura celular provocado por St II parece serfavorecido por la adición de HSA.Los resultados relacionados con la asociación de HSA con St II mostraron que esta interacción es menos probable que ocurra en las condiciones en la que los experimentos fueron realizados. El principal factor responsable de los resultados obtenidos parece ser la asociación masiva de HSA con glóbulos rojos y membranas liposomales que parecen estar afectando el proceso de formación de poros y la menor eficiencia de permeación de liposomas. Sin embargo el aumento en la eficiencia· de los procesos de lisis de glóbulos rojos en presencia de HSA muestra que estos resultados tienen una explicación más compleja.También se estudió la posible influencia del daño oxidativo de HSA en el efecto ejercido por esta proteína en la actividad de la lisozima y de St II. Laoxidación de HSA fue realizada utilizando tres diferentes agentes oxidantes deimportancia biológica: ácido hipocloroso (HOCI), radicales peroxidados (ROO')obtenidos mediante la descomposición térmica del azo-compuesto AAPH yradicales hidroxilo (HO•) obtenidos mediante la reacción de Fenton. Para lalisozima, el tratamiento de la HSA con oxidantes no cambió el mecanismoresponsable de la inactivación de la lisozima provocada por HSA. Sin embargo,HOCI como oxidante de HSA mostró ser capaz de desactivar la enzima demanera más eficiente. Dado que el mecanismo propuesto para la inactivaciónde la lisozima por HSA implica la asociación entre la HSA y la enzima, lamodificación oxidativa de HSA por HOCI parece favorecer la formación decomplejos de HSA/lisozima (evidenciado por los experimentos de microcentrifugación), haciendo más eficiente la inactivación de la enzima.Se analizó el efecto de la oxidación de HSA sobre la actividad de St II probada mediante permeación de liposomas y actividad hemolítica. La actividadde St II mostro ser insensible a la modificación oxidativa de albúmina por todos los agentes oxidantes utilizados. El uso de HSA oxidada no cambiósustancialmente su capacidad de unirse a bicapas lipídicas en liposomas y englóbulos rojos. Este podría ser el motivo principal del escaso efecto que lamodificación oxidativa de HSA tiene sobre la actividad de St II.