| dc.description.abstract | CART (Cocaine- Amphetamine Regulated Transcript} fue descubierto como un RNAmque es inducido por una dosis aguda de cocaína y también de anfetamina en el estriado de cerebro de rata. A partir de su descubrimiento el neuropéptido CART fue vinculado a drogas de abuso, sin embargo existe mayor evidencia que lo vincula al control del apetito. Elneuropéptido CART inhibe potentemente el apetito (efecto anorexigénico} cuando esadministrado intra-cerebralmente a roedores. Una subregión del estriado del cerebro que media el efecto anorexigénico es el núcleo accumbens (NAcc). Inyecciones intra-NAcc del neuropéptido CART en roedores inhiben el apetito de manera dosis dependiente. El NAce esuno de los principales blancos de acción de las drogas de abuso, y es parte del circuito dopaminérgico llamado también circuito de la recompensa y/o motivación.La vinculación entre CART y apetito se hizo aún más evidente con el descubrimiento de una mutación L34F en proCART, que se correlaciona positivamente con un fenotipo deobesidad mórbida en los sujetos portadores de dicha mutación. En los sueros de los sujetos con la mutación L34F, los niveles del neuropéptido CART fueron inferiores que en los sujetoscontroles. Adicionalmente, en los sueros de los sujetos con la mutación se observó mayor presencia de la especie proCART intermediaría (7,7 kDa) que en los sujetos controles. Una explicación a esta observación, fue que la ausencia del neuropéptido CART, en el suero de lossujetos portadores de la mutación L34F, provocaría un desbalance en las señales de apetito y desencadenaría el fenotipo obeso mórbido. Sin embargo, es una incógnita cómo la mutación L34F en proCART provoca la disminución dramática del neuropéptido CART activo. Se hasugerido que el problema sería una alteración en la destinación subcelular de proCART L34F hacia las vesículas de secreción regulada (VSR).En base a estos antecedentes, en la parte 1 de esta tesis se propuso determinar siproCART posee una señal de destinación hacia las VSR, y si la mutación L34F modifica la destinación subcelular de proCART. La aproximación experimental fue expresar heterólogamente quimeras en células PC12. Las quimeras se construyeron con las secuenciasaminoacídicas de proCART fusionadas a la proteína reportera EGFPm. Todas las quimeras incluyen la secuencia aminoacídica del péptido señal de CART. La localización subcelular de las quimeras se contrastó con la de marcadores específicos de las VSR utilizando microscopía confocal, y un análisis de colocalización entre ambas señales. Además, se realizaron ensayosde secreción, monitoreando los niveles de las quimeras en el medio extracelular de las células PC12 transfectadas con las respectivas quimeras. Esta otra aproximación metodológica complementa los resultados de colocalización obtenidos por imagenología. Se compararon los niveles detectados en condiciones basales con los niveles en condiciones de estímulo, usando como secretagogo el BaCl2. La quimera que ingresa a las VSR debe ser sensible a lainducción de la secreción por exposición con BaCl2. Por el contrario, si las quimera en estudio es insensible, se establece que no ingresa a las VSR y se secreta en forma constitutiva.La quimera proCART_EGFPm, que contiene la secuencia completa de proCART fusionada a EGFPm, colocalizó robustamente con los marcadores de VSR y se secretó de manera regulada. Esta quimera mostró un patrón de localización subcelular granular y susecreción fue inducida por un estímulo con BaCl2. De los estudios con las quimeras con distintos fragmentos de proCART, observamos que la inserción de solamente el péptido señal de CART a EGFPm (quimera SP_EGFPm) no es suficiente para el ingreso del reportero a lasVSR. La quimera SP_EGFPm presentó un patrón de localización perinuclear, colocalizando discretamente con los marcadores de las VSR, y fue insensible a la exposición a BaCl2. La inserción de los fragmentos 1-9 y 1-26 de proCART a EGFPm tampoco logró que las quimerasingresaran a las VSR. Sin embargo, la adición del fragmento 1-41 de proCART a EGFPm, cambió el patrón subcelular de perinuclear a granular y su magnitud de colocalización con los marcadores de las VSR fue equivalente a la mostrada por la quimera proCART EGFPm. Por lo tanto, los resultados indican que la información necesaria y suficiente para el ingreso deproCART a las VSR está contenida en los primeros 41 residuos de proCART.Sorpresivamente, al estudiar la mutación L34F, observamos el mismo comportamientosubcelular de proCART_EGFPm. La mutante L34F no modificó significativamente lacolocalización de proCART EGFPm con los marcadores de las VSR y también fue sensible a la estimulación con BaCl2. Por lo tanto, los resultados indican que la mutación L34F no afecta la destinación subcelular de proCART como había sido propuesto en la literatura. Sin embargo,cuando se modificaron al mismo tiempo 5 residuos comprendidos entre los residuos 27 y 41 de proCART (E28A L30A E32A L34F y L37 A), el cambio en el patrón de localización subcelular fue dramático. La quimera proCART (SD mut)_EGFPm, con estas 5 mutaciones mostró: a) un patrón de localización subcelular perinuclear, b) un drástico descenso en la colocalización con los marcadores de las VSR e c) insensibilidad a la estimulación con BaCl2. Por lo tanto, la modificación de los 5 residuos en el segmento 27-41 de proCART cambió drásticamente lalocalización subcelular de proCART, llevándonos a identificar un dominio de destinación (sorting domain} hacia las VSR en proCART. Sin embargo, este dominio de destinación hacia las VSR en proCART aislado y fusionado a EGFPm, fue incapaz de transitar con éxito por la vía de secreción de la célula y no ingresó a las VSR. Por lo tanto, el fragmento 27-41 deproCART fue necesario pero no suficiente para su destinación hacia las VSR.En conclusión, los resultados de la primera parte, sugieren que la ausencia del neuropéptido CART en el suero de los sujetos con la mutación L34F, no se debe a una falla en la destinación hacia las VSR de proCART. Es posible que la mutación L34F afecte el procesamiento de proCART lo que incidiría directamente en la ausencia del neuropéptido activo y la aparición de otras especies intermediarias en los sujetos con la mutación. La ausencia del neuropéptido CART activo podría atenuar las señales de saciedad a nivel central en dichos pacientes.En la parte 11 de esta tesis se estudió el papel del neuropéptido CART en el NAcc, región del cerebro que juega un papel clave en el control del apetito. La primera inquietud a responder fue determinar si el neuropéptido CART es secretado en el NAcc, pregunta básicaque hasta la fecha no había sido abordada. Por medio de ensayos de secreción en estanco, usando trozos de cerebro de rata enriquecidos en NAcc y un radio inmunoensayo específico para CART en esta tesis se demostró que el neuropéptido CART es secretado desde el NAcc. Los niveles extracelulares de CART aumentaron luego de la exposición a un estímulo despolarizante con KCI 55 mM. Además, la secreción del neuropéptido CART inducida por despolarización fue dependiente del calcio extracelular.Una vez demostrado que el neuropéptido CART es secretado en el NAcc, quisimosestudiar los cambios neuroquímicos que genera el neuropéptido CART en el NAcc de rata. Para ello utilizamos microdiálisis in vivo y perfusión inversa del neuropéptido activo, y monitoreamos los niveles extracelulares del neurotransmisor dopamina, clave en lasconductas motivadas. Los niveles de dopamina extracelular se detectaron y cuantificaron utilizando HPLC acoplado a detección amperométrica. La perfusión inversa intra-NAcc del neuropéptido CART 10 ?M, pero no de CART 1 ?M, incrementó significativamente los nivelesextracelulares de dopamina en el NAcc de ratas.En conclusión, en esta tesis se ha demostrado que proCART posee una señal dedestinación hacia las VSR, compuesta por al menos los residuos E28, L30, E32, L34 y L37. La integridad de este dominio de destinación es necesaria pero no suficiente para la correcta destinación de proCART. lnteresantemente, la mutación familiar L34F no afecta la destinaciónhacia la VSR de proCART, por lo que el mecanismo propuesto para explicar su papel en la obesidad de los sujetos que la padecen debiera ser revisado. Además, el neuropéptido CART es secretado en el NAcc y a su vez aumenta los niveles extracelulares de dopamina. En unfuturo se deberá esclarecer si los cambios neuroquímicos inducidos por el neuropéptido CART revelados en esta tesis tienen un papel en las señales de saciedad. Finalmente, se espera que los resultados de esta tesis aporten a la comprensión del mecanismo por el cualCART inhibe el apetito y a la futura elaboración de estrategias farmacológicas para el tratamiento de la obesidad. | |
