Tesis Doctorado
Regulación transcripciónal del gen rfah de salmonella enterica serovar typhi: efecto sobre la expresión diferencial del lipopolisacarido (lps)
Autor
Contreras-O, Lucía Inés
Universidad de Chile
Institución
Resumen
El lipopolisacárido (LPS) es el componente mayoritario de la membrana externa de las bacterias Gram negativas. Por estar expuesto al medio externo, media muchas de las interacciones patógeno-hospedero y contribuye a la virulencia de estas bacterias.Actualmente se reconoce que la estructura del LPS es dinámica, presentando diversasmodificaciones en respuesta a señales ambientales. Estas variaciones estructurales ocurren en todos los dominios de la molécula: el lípido A, el oligosacárido "core" y el polisacárido O (antígeno O).La investigación de nuestro laboratorio se ha dirigido a comprender losmecanismos de regulación de la síntesis del LPS de Salmonella enterica serovar Typhi (5. Typhi) en respuesta a factores ambientales. En trabajos anteriores demostramos que la biosíntesis del "core" del antígeno O requiere la función del gen rfaH. Este codifica para la proteína RfaH, un antiterminador transcripcional que regula positivamente la expresiónde genes de componentes extracelulares y de membrana externa en Enterobacterias.RfaH es el único regulador de la expresión del antígeno O descrito en la literatura. Por esto, planteamos que esta proteína podría mediar la regulación ambiental de la biosíntesis de este polisacárido. De acuerdo a lo anterior, en esta Tesis se propuso la siguiente hipótesis: "La expresión del gen rfaH es regulada por una o más proteínas anivel del promotor en respuesta a condiciones ambientales, y esta regulación se traduce en una expresión diferencial del LPS".En un trabajo previo demostramos que la expresión del gen rfaH es reguladadurante el crecimiento bacteriano. Ensayos de RT-PCR indicaron que los niveles de RNA mensajero de rfaH aumentan en la fase estacionaria de crecimiento bacteriano. Los resultados de esta Tesis, utilizando una fusión del promotor de rfaH al gen reportero lacZ, demuestran que la expresión del gen aumenta en fase logarítmica tardía alcanzando unmáximo en fase estacionaria. Esta regulación fase-dependiente de la expresión de rfaH ocurre a nivel de iniciación de la transcripción . Ensayos de Western blot realizados con una proteína de fusión RfaH-FLAG demostraron que la activación transcripcional del genrfaH se traduce en un aumento de los niveles citoplasmáticos de la proteína en la etapa de transición a fase estacionaria. El análisis de los perfiles de LPS en geles de poliacrilamida-SDS-Tricina reveló que la producción de antígeno O se correlaciona con losniveles de expresión de RfaH, aumentando significativamente en las fases logarítmica tardía y estacionaria. Ensayos de RT-PCR realizados para detectar el RNA mensajero de wbaP, último gen del operón del antígeno O (wba), mostraron un aumento en los nivelesde expresión en fase estacionaria. En conjunto, estos resu ltados ind ican que un aumento en la expresión de rfaH se correlaciona con un aumento en la transcripción del operón wba y, consecuentemente, con una mayor producción de antígeno O.La secuenciación de un fragmento de 334 pb de la región 5' de rfaH reveló posibles secuencias de reconocimiento para dos sistemas que podrían estar implicados en la regulación fase-dependiente de rfaH: el sistema RcsB/C y el factor sigma alternativo RpoN. La participación del sistema RcsB/C se descartó, ya que mutantes nulas en el genrcsB no presentan ningún efecto sobre la transcripción de rfaH ni sobre la síntesis del antígeno O. En cambio, en una mutante ?poN (M161) se pierde la regulación fasedependiente de rfaH y del antígeno O; más aún, tanto la expresión de rfaH como la producción de antígeno O aumentan cuando S. Typhi Ty2 es cultivada en medio limitado en nitrógeno, condición que activa la transcripción por el factor RpoN. Resultados similares se obtuvieron con una mutante en el factor sigma de fase estacionaria RpoS (M103), en la cual también se pierde la regulación por fase de crecimiento de rfaH y del antígeno O. Complementaciones cruzadas realizadas sobre las cepas M103, M161 y la mutante doble M265 (?rpoN?rpoS), indicaron que ambos factores sigma formarían partede una misma vía regulatoria. La complementación con el gen rpoN silvestre restablece el defecto producido por la mutación en rpoS sugiriendo que RpoN actuaría río abajo de RpoS en esta cascada regulatoria.Ensayos de retardo en geles utilizando extractos proteicos citoplasmáticos de lacepa M161 y la región promotora de rfaH como sonda, sugieren que RpoN no regula arfaH interactuando directamente con su promotor, sino que su efecto sería indirecto. Utilizando el sistema de purificación de proteínas mediante esferas magnéticas unidas a una sonda de DNA se detectó una proteína de aproximadamente 20 kDa que se une a laregión promotora, la que podría ser el mediador de la regulación fase-dependiente de rfaH por los factores sigma RpoN y RpoS.Ensayos de extensión del partidor realizados sobre la región promotora de rfaH indicaron la presencia de más de un inicio de la transcripción, lo que podría ser indicativo de la presencia de más de un promotor. De ser así, es probable que uno de ellos fuera el responsable de la transcripción basal de rfaH y que, frente a condiciones de estrés, se produzca el aumento en la transcripción por la actividad del segundo promotor. Aúncuando quedan varias interrogantes por resolver, los resultados de este trabajodemuestran que RpoN y RpoS están involucrados en la expresión diferencial del antígeno O en respuesta condiciones ambientales a través del factor de antiterminación RfaH.