Desregulación de la actividad del factor de transcripción nf-kb mediada por calció en células musculares distróficas mdx

Abstract

La Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad genética recesiva,ligada al cromosoma X, que afecta a 1 de cada 3500 hombres nacidos. La causa de esta enfermedad es la mutación del gen de la distrofina en humanos y en ratones mdx (modelo animal de DMD). La DMD es una enfermedad progresiva que se caracteriza por daños en la membrana de las fibras musculares, infiltración de células inmunes en el músculo,inflamación crónica, daño de sarcómeros, muerte celular y degeneración severa del músculo esquelético. Esto provoca que el paciente pierda la habilidad de caminar entre los 6-12 años de edad y que fallezca antes del alcanzar el primer tercio de vida, por fallas cardiorespiratorias.La proteína distrofina participa en la estabilización de la membrana plasmática,por lo que en fibras que no presentan esta proteína el daño de la membrana es más recurrente.Adicionalmente en la DMD ocurre un proceso inflamatorio persistente y una menor regeneración del tejido muscular. Los proteínas pro-inflamatorias TNF-?, IL-1?, IL-6 e iNOS, se encuentran elevados en pacientes y en modelos animales de la enfermedad. El factor detranscripción NF-?B es un regulador clave de la respuesta inflamatoria. La actividad de NF-?B se encuentra aumentada en músculos de ratón mdx y de pacientes con DMD. En ratones distróficos mdx la inhibición farmacológica o la ablación génica de componentes del sistema de señalización de NF-?B reducen el daño muscular y la expresión de citoquinas pro-inflamatorias. No existen estudios detallados que aborden la contribución de las células musculares en la actividad de NF-?B.Se ha reportado que las células musculares esqueléticas tienen alteraciones en la homeostasis del Ca2+ en condiciones de reposo y frente a despolarización. Resultados previos de nuestro laboratorio indican que NF-?B es activado por estimulación eléctrica encélulas musculares esqueléticas. Esta activación es bloqueada parcialmente por inhibidores de la señalización de Ca2+, mediada por el receptor para IP3 (IP3R) y Receptor de Ryanodina (RyR).El objetivo de esta tesis fue determinar las alteraciones de Ca2+ y la posible relación con el aumento de actividad de NF-?B, observado en músculos distróficos. Se utilizó el modelo de miotubos de ratón wt y mdx para estudiar las alteraciones en el Ca2+ y de NF-?B.Se determinó que la despolarización, inducida por estimulación eléctrica, produce una menor liberación de Ca2+ en miotubos distróficos. Esta señal está asociada con la actividad del receptor de ryanodina (RyR) y con el proceso de acoplamiento excitación contracción.Adicionalmente, la estimulación eléctrica estimuló la actividad de NF-?B sólo en miotubos wt, mientras que en miotubos mdx, existió una disminución de la actividad.La concentración de Ca2+ basal ([Ca2+]bas) esta elevada en miotubos mdx encomparación con miotubos wt (308±6 vs 113±2 nM, p<0.001). En los miotubos distróficos, tanto la inhibición de la entrada de Ca2+, como el bloqueo de la liberación de Ca2+ desde el RyR y IP3R, redujeron de forma significativa la [Ca2+]bas. De forma interesante, la actividad de NF-?B se encontró elevada en miotubos mdx en condiciones de reposo. Existe un aumento de la actividad transcripcional de NF-?B y un aumento de la localización nuclear de lasubunidad p65, las que fueron disminuidas al reducir la [Ca2+]bas.Se estudiaron algunos blancos transcripcionales de NF-?B. Encontramos que la expresión del mRNA de TNF?, IL-1? y IL-6 fueron similares en miotubos wt y mdx, mientras que la expresión de iNOS fue 5 veces mayor en miotubos distróficos. La disminución de laexpresión de la subunidad p65, mediante siRNA, normalizó los niveles de expresión de iNOS, a niveles similares a los wt y la reducción de la [Ca2+]bas redujo la expresión de iNOS,probablemente debido a la disminución de la actividad de NF-?B.Existen evidencias que señalan que la producción de IP3 depende de la función del Receptor para Dihidropiridinas (Cav1.1, DHPR) en células musculares esqueléticas. El tratamiento con nifedipino (inhibidor del DHPR) redujo de forma significativa la [Ca2+]bas y laactivación de NF-?B en miotubos distróficos. Finalmente, el tratamiento de animales con dosis no hipotensivas de nifedipino (1mg/Kg) redujeron, in vivo, la [Ca2+]bas, lo que se relacionó con una disminución de la creatina quinasa plasmática y de la expresión de iNOS,en homogenizados de músculo total.Nosotros proponemos que la actividad de NF-?B es modulada por un aumento de la[Ca2+]bas en miotubos mdx y que este mecanismo puede explicar el aumento de expresión de iNOS en células musculares distróficas. Finalmente, la inhibición de estas vías podría reducir la expresión de iNOS y de esta forma, reducir el daño muscular debido a la hiper-nitrosilación de proteínas involucradas en la homeostasis de Ca2+ y reducir el estrés nitrosilativo existenteen fibras musculares distróficas.