Papel de la vía wnt no canonica en la espinogénesis en neuronas hipocampales

Abstract

Las espinas dendríticas son especializaciones morfológicas post-sinápticas enriquecidas en actina que protruyen de las dendritas y que en las neuronas excitatorias forman el sitio de contacto con la región pre-sináptica. La formación, mantención y maduración morfológica de las espinas dendríticas son eventos altamente regulados y forman parte de los procesos de plasticidad estructural sináptica en los cuales radica la adaptabilidad funcional a largo plazo de los circuitos neuronales. La expresión local y la formación de gradientes de factores tráficos o morfógenos proteicos extracelulares han mostrado ser importantes mediadores en regulación de los cambios en la estructura y función sináptica que ocurren durante el desarrollo neonatal o en respuesta a la actividad sináptica en los circuitos del SNC. Las proteínas Wnt forman una familia de moléculas de señalización célula a célula, altamente conservadas, que participan en la regulación de la proliferación, diferenciación, morfología y migración celular. Dependiendo del contexto celular y de su unión a distintas isoformas de receptores de la familia Frizzled y a otros ca-receptores, los ligandos Wnt señalizan mediante ya sea, la inhibición de GSK3-~ y la inducción de la expresión de genes blancos del factor TCF/LEF, en forma dependiente de la estabilización del coactivador transcripcional ~-catenina, o a través de vías no canónicas independientes de ~-catenina, que involucran la activación de la quinasa N-terminal de c-jun, JNK; la activación de GTPasas monoméricas como Rae y RhoA o la activación de quinasas dependientes de aumentos en el calcio intracelular. La expresión de ciertos ligandos Wnt ha demostrado aumentar durante el período de desarrollo de los circuitos sinápticos del neocortex in vivo y puede ser regulada por la actividad sináptica in vitro. Se ha demostrado que algunos ligandos Wnt participan en la diferenciación estructural pre-sináptica durante el desarrollo neuronal in vitro, desconociéndose su participación en procesos de morfogénesis, maduración o remodelación estructural de la región post-sináptica. Por otra parte, las vías de señalización Wnt no canónicas han mostrado ser importantes reguladores de la morfología y migración celular en células epiteliales a través de mecanismos similares a los que participan en los cambios morfológicos asociados al desarrollo post-sináptico y a la formación de espinas dendríticas. En base a lo anterior, nos planteamos la siguiente hipótesis: "La vías de señalización Wnt no-canónicas participan en la formación de espinas dendríticas en neuronas hipocampales". El objetivo general de este proyecto es evaluar si las vías de señalización Wnt tienen roles en el desarrollo post-sináptico en el sistema nervioso central. Como primera aproximación, se evaluó si ligandos Wnt que han demostrado activar las vías de señalización Wnt canónicas, Wnt-3a; y no canónicas, Wnt-5a, son capaces de inducir cambios en la densidad y morfología de las espinas dendríticas en neuronas hipocampales durante el período de desarrollo post-sináptico in vitro. Se pudo determinar que el ligando Wnt- 5a, pero no así el ligando Wnt-3a, indujo un aumento neto en la proporción de espinas dendríticas maduras a los 120 minutos de tratamiento a través de un mecanismo que involucra un aumento transiente en el número de protrusiones dendríticas inmaduras principalmente consistente en filopodios y protrusiones pequeñas. El análisis por videomicroscopía de los efectos de Wnt-5a evidenció la aparición de protrusiones dendríticas que son generadas de novo desde el tronco dendrítico, así como de aumentos de tamaño de protrusiones dendríticas preexistentes. La expresión de espinas dendríticas maduras está altamente correlacionada con la agregación de la proteína de la densidad post-sináptica, PSD-95, en los sitios sinápticos. En forma consistente con lo anterior, el ligando Wnt-5a incubado por 2 horas en neuronas hipocampales, indujo un aumento en el número de espinas dendríticas que contienen agregados de PSD-95 y un aumento neto en la densidad total de agregados en las dendritas, los que demostraron formarse a partir de la fracción difusa de la proteína. El ligando Wnt-5a demostró activar las vías Wnt no canónicas Wnt/JNK y Wnt/calcio en neuronas hipocampales. La inhibición farmacológica de JNK, pero no de los efectores de la vía Wnt/Calcio, PKC y CamKII; demostró inhibir el aumento en la densidad de espinas dendríticas inducida por Wnt-5a. La vía de señalización Wnt!JNK ha demostrado ser activada a través de receptores Frizzled en forma mediada por el adaptador intracelular Dishevelled y su interacción con la proteína G monomérica Rae o por la activación del receptor de Wnt-5a, ROR2. El silenciamiento y la sobreexpresión de la isoforma Dvll, mostró no tener efectos en el aumento de la densidad de espinas dendríticas durante el desarrollo y en respuesta al ligando Wnt-5a. En cambio, la sobreexpresión de Dvl-2 fue suficiente para inducir un aumento en la densidad de espinas dendríticas, imitando los efectos de Wnt-5a en neuronas hipocampales. Por otra parte, la sobreexpresión del receptor ROR2 no indujo un aumento significativo en la densidad de espinas dendríticas, pero una construcción dominante negativa del receptor que carece del dominio CRD de unión al ligando, demostró reducir el número de protrusiones dendríticas. El análisis de la morfología de las espinas dendríticas de las neuronas que sobreexpresan ROR2 o sus constructos de deleción dominantes negativas, indicó que las neuronas que expresan mutantes de deleción de ROR2 y que carecen de la porción intracelular C-terminal, poseen una menor proporción de espinas dendríticas con morfología madura. Estos resultados indican que la vía de señalización no canónica Wnt/JNK, a través del ligando Wnt-5a, promueve la formación de espinas dendríticas en neuronas hipocampales a través de un mecanismo que sería dependiente del receptor ROR2 y la isoforma de Dishevelled Dvl2. Además el receptor ROR2 participaría en la maduración morfológica de espinas dendríticas.