| dc.description.abstract | Las espinas dendríticas son especializaciones morfológicas post-sinápticas enriquecidas
en actina que protruyen de las dendritas y que en las neuronas excitatorias forman el sitio de
contacto con la región pre-sináptica. La formación, mantención y maduración morfológica de las
espinas dendríticas son eventos altamente regulados y forman parte de los procesos de
plasticidad estructural sináptica en los cuales radica la adaptabilidad funcional a largo plazo de
los circuitos neuronales. La expresión local y la formación de gradientes de factores tráficos o
morfógenos proteicos extracelulares han mostrado ser importantes mediadores en regulación de
los cambios en la estructura y función sináptica que ocurren durante el desarrollo neonatal o en
respuesta a la actividad sináptica en los circuitos del SNC. Las proteínas Wnt forman una familia
de moléculas de señalización célula a célula, altamente conservadas, que participan en la
regulación de la proliferación, diferenciación, morfología y migración celular. Dependiendo del
contexto celular y de su unión a distintas isoformas de receptores de la familia Frizzled y a otros
ca-receptores, los ligandos Wnt señalizan mediante ya sea, la inhibición de GSK3-~ y la
inducción de la expresión de genes blancos del factor TCF/LEF, en forma dependiente de la
estabilización del coactivador transcripcional ~-catenina, o a través de vías no canónicas
independientes de ~-catenina, que involucran la activación de la quinasa N-terminal de c-jun,
JNK; la activación de GTPasas monoméricas como Rae y RhoA o la activación de quinasas
dependientes de aumentos en el calcio intracelular.
La expresión de ciertos ligandos Wnt ha demostrado aumentar durante el período de
desarrollo de los circuitos sinápticos del neocortex in vivo y puede ser regulada por la actividad
sináptica in vitro. Se ha demostrado que algunos ligandos Wnt participan en la diferenciación
estructural pre-sináptica durante el desarrollo neuronal in vitro, desconociéndose su participación en procesos de morfogénesis, maduración o remodelación estructural de la región post-sináptica.
Por otra parte, las vías de señalización Wnt no canónicas han mostrado ser importantes
reguladores de la morfología y migración celular en células epiteliales a través de mecanismos
similares a los que participan en los cambios morfológicos asociados al desarrollo post-sináptico
y a la formación de espinas dendríticas.
En base a lo anterior, nos planteamos la siguiente hipótesis: "La vías de señalización Wnt
no-canónicas participan en la formación de espinas dendríticas en neuronas hipocampales".
El objetivo general de este proyecto es evaluar si las vías de señalización Wnt tienen roles en el
desarrollo post-sináptico en el sistema nervioso central.
Como primera aproximación, se evaluó si ligandos Wnt que han demostrado activar las
vías de señalización Wnt canónicas, Wnt-3a; y no canónicas, Wnt-5a, son capaces de inducir
cambios en la densidad y morfología de las espinas dendríticas en neuronas hipocampales
durante el período de desarrollo post-sináptico in vitro. Se pudo determinar que el ligando Wnt-
5a, pero no así el ligando Wnt-3a, indujo un aumento neto en la proporción de espinas
dendríticas maduras a los 120 minutos de tratamiento a través de un mecanismo que involucra un
aumento transiente en el número de protrusiones dendríticas inmaduras principalmente
consistente en filopodios y protrusiones pequeñas. El análisis por videomicroscopía de los
efectos de Wnt-5a evidenció la aparición de protrusiones dendríticas que son generadas de novo
desde el tronco dendrítico, así como de aumentos de tamaño de protrusiones dendríticas
preexistentes. La expresión de espinas dendríticas maduras está altamente correlacionada con la
agregación de la proteína de la densidad post-sináptica, PSD-95, en los sitios sinápticos. En
forma consistente con lo anterior, el ligando Wnt-5a incubado por 2 horas en neuronas
hipocampales, indujo un aumento en el número de espinas dendríticas que contienen agregados
de PSD-95 y un aumento neto en la densidad total de agregados en las dendritas, los que
demostraron formarse a partir de la fracción difusa de la proteína. El ligando Wnt-5a demostró
activar las vías Wnt no canónicas Wnt/JNK y Wnt/calcio en neuronas hipocampales. La
inhibición farmacológica de JNK, pero no de los efectores de la vía Wnt/Calcio, PKC y CamKII;
demostró inhibir el aumento en la densidad de espinas dendríticas inducida por Wnt-5a. La vía de
señalización Wnt!JNK ha demostrado ser activada a través de receptores Frizzled en forma
mediada por el adaptador intracelular Dishevelled y su interacción con la proteína G monomérica
Rae o por la activación del receptor de Wnt-5a, ROR2. El silenciamiento y la sobreexpresión de
la isoforma Dvll, mostró no tener efectos en el aumento de la densidad de espinas dendríticas
durante el desarrollo y en respuesta al ligando Wnt-5a. En cambio, la sobreexpresión de Dvl-2
fue suficiente para inducir un aumento en la densidad de espinas dendríticas, imitando los efectos
de Wnt-5a en neuronas hipocampales. Por otra parte, la sobreexpresión del receptor ROR2 no
indujo un aumento significativo en la densidad de espinas dendríticas, pero una construcción
dominante negativa del receptor que carece del dominio CRD de unión al ligando, demostró
reducir el número de protrusiones dendríticas. El análisis de la morfología de las espinas
dendríticas de las neuronas que sobreexpresan ROR2 o sus constructos de deleción dominantes
negativas, indicó que las neuronas que expresan mutantes de deleción de ROR2 y que carecen de
la porción intracelular C-terminal, poseen una menor proporción de espinas dendríticas con
morfología madura. Estos resultados indican que la vía de señalización no canónica Wnt/JNK, a
través del ligando Wnt-5a, promueve la formación de espinas dendríticas en neuronas
hipocampales a través de un mecanismo que sería dependiente del receptor ROR2 y la isoforma
de Dishevelled Dvl2. Además el receptor ROR2 participaría en la maduración morfológica de
espinas dendríticas. | |
