Tesis Doctorado
Función dual de p73 durante la espermatogénesis: efectos sobre la diferenciación y en la apoptosis de las células espermatogénicas
Autor
Alvarez , Alejandra
Pontificia Universiad Católica de Chile
Institución
Resumen
La espermatogénesis es el proceso a través del cual se forman espermatozoides
haploides a partir de células diploides conocidas como espermatogonias. Este proceso de
diferenciación se caracteriza por que las células espermatogénicas pueden; i) iniciar
exitosamente la expresión de proteínas específicas de su estado diferenciado o ii) iniciar
su autoeliminación por apoptosis. La desregulación en el proceso de apoptosis y/o del de
diferenciación de las células germinales induce diferentes anormalidades en los túbulos
seminíferos que pueden generar la infertilidad de los individuos. Sin embrago, las vías de
señalización celular que participan en dichos procesos son pobremente conocidas.
Los miembros de la familia de factores de transcripción de p53, han surgido en los
últimos años, como elementos centrales que integran las señales de diferentes vías de
señalización y que determinan la respuesta celular regulando la proliferación,
diferenciación y/o apoptosis. Se ha descrito que p53 esta presente en el testículo, en
donde participaría en el arresto celular previo a la meiosis de los espermatocitos, sin
embargo su papel en la inducción de la apoptosis fisiológica, a diferencia de otros
modelos celulares, sería poco relevante, sugiriendo la participación de otros miembros
de la familia de p53 capaces de regular la decisión entre apoptosis y diferenciación.
p73 es un miembro de la familia, el cual se ha demostrado que tiene, al igual que
p53, la capacidad de inducir apoptosis. p73 esta presente en testículos adultos, al igual
que su principal activador postraduccional, la proteína quinasa c-Abl. Sin embargo, su papel en este modelo es desconocido. Además p73 participa en la diferenciación celular
en diferentes tipos celulares, tales como oligodendrocitos, neuroblastoma o células
miogénicas. Los ratones nulos para esta proteína presentan severas fallas en el desarrollo
que desencadenan una temprana mortalidad. Dentro de este contexto, el foco del
presente estudio fue evaluar de la posible participación de p73 durante la
espermatogénesis; evaluando su función en i) la apoptosis fisiológica como también ii) en
la diferenciación de las células germinales masculinas.
Primero evaluamos el patrón de expresión proteica para p73 y c-Abl durante el
desarrollo temprano del testículo de la rata. Observamos que tanto p73 como c-Abl se
expresan durante la primera onda espermatogénica; entre los días post natal S y 45.
Ambas proteínas están incrementadas hacia el día 25, principalmente en espermatocitos,
en donde ca-localizan. Dada que a esta edad, el día 25, ocurre el pico de apoptosis
fisiológica, decidimos evaluar los efectos de STIS71 (STI), un conocido inhibidor de la
quinasa c-Abl. Observamos que STI disminuyó significativamente los niveles de p73 y, más
aún, de la forma activa de ésta, la fosfo-p73, lo cual se asoció a una disminución
significativa de la apoptosis fisiológica de las células germinales. lnteresantemente, el
tratamiento con Pifitrina, un conocido fármaco inhibidor de p53, no afectó (en ninguna de
las dosis probadas) la apoptosis de las células germinales. Más aun, los testículos tratados
con STI presentaron niveles normales de p53, sugiriendo de esta manera, que la
disminución en los niveles de p73, y no de p53, está asociada a la prevención de la
apoptosis fisiológica. Por otra parte, observamos que las células en apoptosis, túnel positivas, también
eran positivas para fosfo-p73. Mediante imunoprecipitación aislamos células germinales
FAS positivas, las cuales son la principal población celular que entra apoptosis fisiológica.
Observamos que c-Abl, p73 y su forma activa fosfo-p73 están incrementados en las
células FAS positivas, y sus niveles que disminuyen con el tratamiento con STI. Más aun,
la isoforma pro-apoptótica de p73, TAp73 muestra mayores niveles en las células
apoptóticas, sugiriendo de esta manera la participación de p73, a través de isoforma
TAp73, en modulación de apoptosis en las células germinales.
Para corroborar la importancia de p73 en la apoptosis durante la
espermatogénesis, decidimos evaluar ésta en testículos de animales heterocigotos y
nulos para p73. Coherente con la participación de p73 en la inducción de apoptosis
observamos que la disminución mono alélica de p73 es suficiente para disminuir
significativamente la apoptosis. Sin embargo, también los ratones nulos para p73 poseen
un número significativamente mayor de células en apoptosis asociado al aumento en
proteínas proapoptóticas como BAX y caspasa-3 activa. Además, observamos que la
morfología y estructura de los túbulos seminíferos estaba altamente alterada. Este
resultado sugiere que p73, y probablemente la isoforma L1Np73, tiene funciones
adicionales en el testículo, asociadas a proliferación y sobrevida, que se ven alteradas en
los ratones nulos, generando la muerte celular masiva y fallas en la progresión
espermatogénica que acusa el fenotipo de los ratones.
Adicionalmente, para profundizar en la función de p73 en apoptosis, evaluamos la
participación de ésta en un modelo distinto de apoptosis de células germinales, la apoptosis inducida por un agente de daño al DNA. Observamos que p73 participa en la
apoptosis inducida por etoposido en el testículo, pero a diferencia de la apoptosis
fisiológica, p53 participaría en compañía p73 en la inducción de esta. Es así como, en un
modelo de célula germinal en cultivo, la línea celular GC2, la inhibición tanto de p73
como de p53 con RNAs de interferencia, reduce significativamente la apoptósis de las
células, inducida por etopósido in vitro. lnteresantemente, encontramos que STI y
Pifitrina {a diferencia de lo observado en la apoptosis fisiológica) reducen los niveles de
p73 in vivo lo cual también se ve asociado a disminuciones en los niveles de apoptosis
principalmente de espermatocitos primarios. Estos resultados indicarían que en el
testículo, p73 participaría en vías de señalización diferentes para la inducción de la
apoptosis de las células germinales, lo cual dependería del estímulo con cual ésta se
induzca, ya sea fisiológico o exógeno {etoposide).
La participación de p73 en diversos procesos de diferenciación y los marcados
cambios en el desarrollo de los testículos en los animales nulos para p73, sugiere la
participación de p73, no sólo en la apoptosis fisiológica, sino también un papel en la
diferenciación de las células germinales masculinas.
Para evaluar la diferenciación de células germinales masculinas, elegimos un
modelo celular in vitro, la línea tipo célula germinal GC2-spg. Esto, dada la imposibilidad
técnica de cultivos primarios de larga duración de células germinales. La línea GC2-spg
expresa una versión termosensible de p53, la que se activa sólo parcialmente a 3rC
{denominadas GC2), dando a las células características de espermatocitos. Sin embargo a
32°C {denominadas GC2/32) aumentan los niveles de p53 activa y las células presentan características más diferenciadas tipo espermátida. Comprobamos que dicha línea
incubada a 3rC expresa parcialmente p53, y presenta características similares a los
espermatocitos; mientras que a 32°C, situación en que incrementa los niveles de p53
activa, se observan mayores niveles de p21, asociado a arresto en el ciclo celular y
disminución en la proliferación. Éstas células, que llamamos GC2/32, las cuales tienen
características de espermátida. Concordantemente, encontramos que células GC2
expresaron mayores niveles del marcador de espermatocito SCP3 y menores de acrosina
(marcador espermátida}. En contraste, las células GC2/32 mostraron bajos niveles de
SCP3 y altos de acrosina. Además, encontramos diferencias en la distribución del
citoesquelto de tubulina y disminución en el tamaño celular cambios característicos de la
diferenciación de espermatocitos a espermatidas. Sin embargo fuimos incapaces de
encontrar diferencias en la ploidía de las células en las células GC2/32, lo cual indicaría su
inhabilidad de llevar a cabo el proceso meiótico. Tras estas observaciones, postulamos
que la línea GC2-spg es una herramienta útil para observar ciertos eventos asociados a la
diferenciación celular de manera in vitro, pero no constituye un modelo completo de la
espermatogénesis.
Utilizando esta línea observamos la activación de la vía c-Abl/p73 en células más
diferenciadas GC2/32, y es así como observamos un aumento en los niveles de p73 activa
(fosfo-p73} y un cambio de distribución celular de c-Abl desde el citoplasma hacia el
núcleo. lnteresantemente, observamos que la sobre-expresión de TAp73 (ya sea a través
de transfección o con transducción con adenovirus} en células GC2 incrementa
significativamente el marcador SCP3 y no acrosina. Este aumento es reversible cuando utilizamos RNAs de interferencia específicos contra p73, comprobando de esta manera la
especificad de p73 en inducción de SCP3. Para evaluar si p73 modula, in vivo, la expresión
de SCP3 analizamos la expresión de esta última en ratones nulos para p73 e
interesantemente observamos, tanto por western Blot como por inmunohistoquímica,
que los ratones p73 -/-muestran menores niveles de SCP3.
Finalmente evaluamos la relevancia de p73 en el desarrollo testicular analizando
la progresión espermatogénica en ratones heterocigotos y nulos para p73. Observamos
que los testículos de ratones prepuberales p73 -/- casi no presentan la formación de
túbulos seminíferos, en contraste con lo observado en animales heterocigotos p73 +/- y
silvestres de su misma edad. Además, ratones heterocigotos adultos presentan
alteraciones en la espermatogenesis evidenciada por: i) alteraciones en morfología de los
tú bulos seminíferos tanto, la altura del epitelio seminífero, como el diámetro y el área de
los túbulos seminíferos; ii) diferencias en las poblaciones de células en los distintos
estadios en los túbulos entre los testículos de los animales silvestres y los p73 +/-, lo cual
indica fallas en la progresión de la espermatogénesis de estos últimos; iii) y finalmente,
los espermatozoides producidos por los ratones p73 +/- poseen menores niveles de
fosforilación en tirosina (propiedad que adquieren durante la capacitación) y de reacción
acrosomal, sugiriendo de esta manera que la ausencia mono alélica de p73 genera una
espermatogénesis defectuosa y espermatozoides de baja calidad. Sin embargo, no
observamos diferencias significativas en las tasas de fertilidad de los animales p73 +/-en
comparación con los silvestres. Es probable que sea la robustez del sistema reproductor
masculino, en el cual se producen un alto número final de espermatozoides, lo que provoque la reversión de fallas medias del sistema y brinda una mayor eficiencia del
modelo. Estos resultados apoyan la que p73 es requerido para la diferenciación de las
células espermatogénicas.
Todos los antecedentes encontrados indican que p73 participa y es requerido
para la progresión de la espermatogénesis. Es así como este factor de transcripción
presenta dualidad de funciones participando tanto en la apoptosis fisiológica durante la
primera onda de la espermatogénesis, como en la modulación de algunos marcadores de
diferenciación celular. La ausencia, ya sea parcial de p73, genera alteraciones en la
estructura los túbulos seminíferos, en la progresión de las células germinales y en los
espermatozoides producidos por estos. Estos resultados sugieren que también es este
modelo p73 y sus isoformas serían elementos claves orquestando la decisión de las
células entre, proliferación, apoptosis y diferenciación.