Tesis Doctorado
Participación de proteínas-g en el proceso de maduración inducido por progesterona en ovocitos de xenopus laevis
Autor
Olate-A, Juan
Universidad de Concepción
Institución
Resumen
La hormona progesterona induce el proceso de maduración meiótica del ovocito
de Xenopus laevis a través de un mecanismo de acción no genómico, el cual se
caracteriza por ser un evento rápido en el tiempo y que involucra la inhibición del
sistema efector adenilil ciclasa (AC). La participación de proteínas G en el proceso
de maduración se basa principalmente en el hecho que el efecto inhibidor del
esteroide es dependiente de GTP. Sin embargo, hasta el momento la identidad de
la proteína G involucrada en este proceso no ha sido definida de manera directa,
aunque posiblemente Gas sería el modulador involucrado. Recientemente se ha
postulado que el heterodímero G3y de la proteína G también estaría directamente
involucrado en el control del proceso de maduración, manteniendo activa la AC en
forma constitutiva y por lo tanto bloqueando la entrada del ovocito a la transición
G2/M del ciclo celular. Ha sido propuesto que progesterona actúa interfiriendo con
la activación de la AC por Gas y Gy.
En este trabajo de tesis se estudió cómo los cambios en los niveles de Gas
afectan el proceso de maduración inducido por progesterona. Se encontró que la
sobre expresión en el ovocito de la Gas silvestre de X. laevis y de la mutante
constitutiva mente activa Ga5QL, bloquearon la maduración inducida por
progesterona, siendo más efectiva la mutante GasQL que la forma silvestre. Por
otro lado, la depleción de la Gas endógena, utilizándose oligonucleótidos sin
sentido, causó maduración espontánea del ovocito y activación de la vía MARK.
Estos resultados indican claramente que la presencia de Gas en el ovocito es necesaria para mantener el ovocito detenido en la interfase G2/M. Para analizar
en mayor detalle la participación de Gas, se estudió el efecto de dos mutantes
dominantes negativas para Gas. Se encontró que la mutante dGas acelera el
proceso de maduración inducido por progesterona, y la mutante DGas causa
maduración espontánea, sin embargo la coinyección de la subunidad Gftj revierte
el efecto inductor de la maduración de la dominante negativa, lo que indicaría que
la dominante negativa estaría actuando como proteína secuestradora de Gí37 y no
sería capaz de desacoplar a Gas endógena de un receptor activado.
La sobre-expresión de receptores del tipo GPCR como el 32AR y los receptores
muscarinícos M4 y M5, causaron una inhibición de la activación de la vía MAPK
por progesterona. El efecto observado se debería a que estos receptores al ser
activados por sus respectivos ligandos inducen la liberación de G37 desde su
respectiva Gu, la cual junto con Gas-GTP, activan la AC. Para corroborar la
participación de G3y en el proceso de maduración, se expresaron diferentes
subunidades Ga, con el objeto de secuestrar Gy e inducir maduración. Se
observó que Gcto induce el proceso de maduración, indicando que es un fuerte
secuestrador de Gy.
También se investigó el mecanismo por el cual progesterona podría estar
afectando el intercambio GDP/GTP por parte de la proteína Gas. No se observó
ningún efecto del esteroide sobre la capacidad de Gas de intercambiar nucleótido,
incluso en un sistema activado por el ligando isoproterenol, indicando que
progesterona no afecta directamente la función GEF del complejo hormonareceptor.
Al respecto, se clonó desde ovocitos el cADN codificante para una proteína denominada sinembrina (xSin) y que posee actividad GEF. Se observó
que la microinyección del ARNm para xSin bloqueó la maduración y su depleción
por el uso de siARN aceleró el proceso, indicando la participación de esta proteína
en la maduración meiótica. Basados en los resultados obtenidos en esta tesis se
propone que Gas y G3y estarían participando en la mantención del estado
inmaduro del ovocito, activando la AC y elevando los niveles de cAMP. Nosotros
proponemos que el activador endógeno de Gas sería la proteína sinembrina, a
través de su actividad GEF. Progesterona, a través de un mecanismo aún
desconocido, interferiría con la función de sinembrina con la consecuente caída en
los niveles de cAMP y maduración del ovocito.