Tesis Doctorado
Estudio de papel de ión cobre sobre la agregación y neurotoxicidad del peptido beta-amiloide.
Autor
Inestrosa-Cantin, Nibaldo Manuel
Pontificia Universidad Católica de Chile
Institución
Resumen
Las regiones del hipocampo y la corteza del cerebro de pacientes con la enfermedad de Alzheimer, presentan (i) una extensa muerte neurona¡ en conjunto con (u) una acumulación de oligómeros proteícos y (iii) un incremento generalizado de los productos de daño oxidativo, cuya formación podría preceder la acumulación de los oligómeros proteícos, responsables putativos de la pérdida progresiva de las capacidades cognitivas observadas en la AD. El principal componente de los depósitos de oligómeros proteícos, llamados placas seniles, es el péptido 13-amiloide, que es el producto del corte proteolítico de la proteína precursora del amiloide. La hipótesis que propone a los oligómeros del péptido AJ3 como responsables del daño neurona] desarrollado en la AD, se ha fortalecido con las evidencias obtenidas por estudios genéticos, de biología celular y bioquímicos. Dentro de este contexto, se ha propuesto que moléculas orgánicas o inorgánicas que interfieran en el proceso de agregación modularían la toxicidad del péptido Aft Al respecto, es interesante que en las SP se encuentran acumulados metales de transición como cobre, hierro y zinc, lo que sugiere que interacciones entre el péptido AF3 y estos metales estarían ocurriendo, al menos en condiciones patológicas. Además, el péptido AÍ3 presenta tres histidinas en su secuencia, aminoácidos que coordinan metales de transición como el cobre. Este evento podría promover la formación de agregados de amiloide y la formación de las especies reactivas de oxígeno responsables del daño oxidativo detectado en la AD. Con estos antecedentes, se planteó la siguiente hipótesis: "La agregación y neurotoxicidad del péptido AÍ3 es modulada por el ión cobre". Por lo tanto, durante el desarrollo de esta Tesis doctoral, se estudió el papel del ión cobre sobre la neurotoxicidad del péptido A13, evaluando los siguientes aspectos: i) La agregación y la (ji) neurotoxicidad de los oligómeros del péptido - amiloide formados en presencia del ión cobre. iii) Las formación de especies reactivas de oxígeno por el complejo Aí3 -Cu y su (iv) implicancia en la neurotoxicidad. Los resultados indican que el ión cobre acelera la agregación del péptido Aamiloide, formando complejos bioinorgánicos neurotóxicos. Los agregados del péptido A3 fueron (i) congofilicos, (u) birrefringentes y (iii) resistentes a la degradación por tripsina. La presencia del ión cobre disminuye el tamaño de las fibras de amiloide en forma dependiente de la concentración del metal. Las fibras formadas a la razón molar At3/cobre, 1/1, asocian cobre a su estructura (50%). Estas fibras son tóxicas para cultivos primarios de hipocampo de rata, lo que se manifiesta como: (i) la pérdida de la extensión de las neuritas, (ji) la deslocalización de las mitocondrias y (iii) la disminución de la actividad metabólica. Finalmente, el péptido AÍ3 coinyectado con cobre (razón molar 1: 1) en la región del hipocampo dorsal de rata, forma agregados de amiloide, los cuáles no fueron detectados en el hipocampo de ratas inyectadas con el péptido AÍ3 solo, reforzando la idea que el ión cobre podría acelerar la formación de oligómeros de A3 in VIVO. En este contexto, se presenta un modelo que explicaría cómo el ión cobre facilitaría la transición del A3 desde un estado noamiloidogénico a un estado amiloidogánico. En resumen, se propone que el ión cobre podría ser una molécula accesoria que favorecería la formación de agregados de amiloide in vivo. Además el complejo Aí3-Cu cataliza la formación in vi/ro de peróxido de hidrógeno a través de la reducción del ión cobre y la transferencia de electrones desde agentes reductores. El péptido A3 reduce al cobre desde Cu(II) a Cu(l), como se determinó con el indicador de Cu(1), Batocupreína. Se estableció, a través del ensayo de diclorofluresceína acoplado a peroxidasa, que el Ap al coordinar 2 eq de Cu(II), forma peróxido de hidrógeno aceptando electrones desde moléculas biológicas como la vitamina C, L-DOPA, colesterol, progesterona y catecolaminas. La formación de 1-1202 en presencia de dopamina fue una reacción catalizada tanto por el complejo A13 -Cu sintético (Vmax aparente = 1,2 i,moles/min, Km aparente = 8,9 p.M), como por e! complejo A3-Cu purificado desde SP de cerebros de pacientes con AD, indicando que esta reacción podría estar ocurriendo in vivo. Es interesante destacar que la dopamina potenció la neurotoxicidad del complejo AJ3-Cu. Este efecto fue inhibido por la presencia de catalasa, indicando que la neurotoxicidad generada por el complejo Aí3-Cu fue mediada por la formación de 1-1202. Además, el complejo A-Cu forma 1-1202 usando vitamina C como sustrato, en forma similar a la superóxido dismutasa deficiente de Zn (Cu-ESOD1), enzima relacionada con la esclerosis lateral amielotrófica de tipo familiar, enfermedadque explicaría cómo el ión cobre facilitaría la transición del A3 desde un estado noamiloidogénico a un estado amiloidogánico. En resumen, se propone que el ión cobre podría ser una molécula accesoria que favorecería la formación de agregados de amiloide in vivo. Además el complejo Aí3-Cu cataliza la formación in vi/ro de peróxido de hidrógeno a través de la reducción del ión cobre y la transferencia de electrones desde agentes reductores. El péptido A3 reduce al cobre desde Cu(II) a Cu(l), como se determinó con el indicador de Cu(1), Batocupreína. Se estableció, a través del ensayo de diclorofluresceína acoplado a peroxidasa, que el Ap al coordinar 2 eq de Cu(II), forma peróxido de hidrógeno aceptando electrones desde moléculas biológicas como la vitamina C, L-DOPA, colesterol, progesterona y catecolaminas. La formación de 1-1202 en presencia de dopamina fue una reacción catalizada tanto por el complejo A13 -Cu sintético (Vmax aparente = 1,2 i,moles/min, Km aparente = 8,9 p.M), como por e! complejo A3-Cu purificado desde SP de cerebros de pacientes con AD, indicando que esta reacción podría estar ocurriendo in vivo. Es interesante destacar que la dopamina potenció la neurotoxicidad del complejo AJ3-Cu. Este efecto fue inhibido por la presencia de catalasa, indicando que la neurotoxicidad generada por el complejo Aí3-Cu fue mediada por la formación de 1-1202. Además, el complejo A-Cu forma 1-1202 usando vitamina C como sustrato, en forma similar a la superóxido dismutasa deficiente de Zn (Cu-ESOD1), enzima relacionada con la esclerosis lateral amielotrófica de tipo familiar, enfermedad que explicaría cómo el ión cobre facilitaría la transición del A3 desde un estado noamiloidogénico a un estado amiloidogánico. En resumen, se propone que el ión cobre podría ser una molécula accesoria que favorecería la formación de agregados de amiloide in vivo. Además el complejo Aí3-Cu cataliza la formación in vi/ro de peróxido de hidrógeno a través de la reducción del ión cobre y la transferencia de electrones desde agentes reductores. El péptido A3 reduce al cobre desde Cu(II) a Cu(l), como se determinó con el indicador de Cu(1), Batocupreína. Se estableció, a través del ensayo de diclorofluresceína acoplado a peroxidasa, que el Ap al coordinar 2 eq de Cu(II), forma peróxido de hidrógeno aceptando electrones desde moléculas biológicas como la vitamina C, L-DOPA, colesterol, progesterona y catecolaminas. La formación de 1-1202 en presencia de dopamina fue una reacción catalizada tanto por el complejo A13 -Cu sintético (Vmax aparente = 1,2 i,moles/min, Km aparente = 8,9 p.M), como por e! complejo A3-Cu purificado desde SP de cerebros de pacientes con AD, indicando que esta reacción podría estar ocurriendo in vivo. Es interesante destacar que la dopamina potenció la neurotoxicidad del complejo AJ3-Cu. Este efecto fue inhibido por la presencia de catalasa, indicando que la neurotoxicidad generada por el complejo Aí3-Cu fue mediada por la formación de 1-1202. Además, el complejo A-Cu forma 1-1202 usando vitamina C como sustrato, en forma similar a la superóxido dismutasa deficiente de Zn (Cu-ESOD1), enzima relacionada con la esclerosis lateral amielotrófica de tipo familiar, enfermedad caracterizada por la pérdida de las neuronas motoras. Esto sugiere que ambos complejos bioinorgánicos formarían H2 02 a través de un mecanismo común. Analizando los resultados en conjunto, estos sugieren que el ión cobre podría mediar la neurotoxicidad del péptido A, al menos por dos mecanismos. (i) El primer mecanismo propone al ión cobre como un acelerador de la formación de agregados de amiloide con propiedades neurotóxicas intrínsecas. El metal induciría un cambio estructural del Ap facilitando su transición desde un estado soluble a un estado insoluble. Este evento podría tener un impacto sobre la formación, consolidación y arquitectura de las SP, donde el contenido, la coordinación y la localización del metal dentro de estos agregados podría definir zonas más resistentes a la acción de proteasas. (u) El segundo mecanismo propone la formación de un complejo bioinórganico entre el metal y el péptido A3, capaz de catalizar la transferencia de los electrones desde agentes reductores al oxigeno molecular formándose como producto 1-1207. Como extensión de este último hallazgo, se propone un modelo que explicaría, al menos en parte, la generación de especies reactivas de oxigeno responsables del daño oxidativo presente en la AD.