Tesis Doctorado
Estudio de las propiedades fisicoquímicas de la lamela y su influencia en la estructura secundaria y en la actividad atpásica de na, k-atpasa reconstituída en modelos de membranas
Autor
Sotomayor-López, Carlos Patricio
Pontificia Universidad Católica De Valparaíso
Institución
Resumen
La enzima Na,K-ATPasa (ATP fosfohidrolasa Na/K transportador) (EC
3.6.1.37) es una proteína integral de membrana que sufre cambios
conformacionales durante su ciclo catalítico. Diversas evidencias
experimentales indican que cambios en las propiedades de la membrana
mediados por agentes externos o por variaciones en la composición lipídica,
afectan la actividad ATPásica de la proteína.
En la presente tesis se planteó el problema de correlacionar el efecto de
variaciones del contenido de colesterol de la membrana sobre la actividad de
la enzima, con los cambios en las propiedades de dominios específicos de la
lamela. Debido a la alta complejidad de las membranas biológicas, en cuanto
al contenido lipídico y proteico, el estudio se realizó en vesículas de lípidos
naturales de diferente complejidad con la enzima altamente purificada y
reconstituída en la membrana. Los resultados de las medidas de actividad de
la enzima indican que el colesterol produce abruptas variaciones con máximo:;
de actividad a 26 y 33,3 mol O/,, de colesterol para vesículas constituidas por
PC:Colesterol, y a 24 y 33,3 mol % para vesículas de PC;PE:PI:Colesterol. Por
otra parte, en el estudio de las propiedades fisicoquímicas de la lamela se
utilizaron técnicas resueltas en el tiempo de espectroscopia de fluorescencia j
técnicas de espectroscopia infrarroja. Los resultados obtenidos por
fluorescencia resueltas en el tiempo de sondas derivadas de DPH y en estado
estacionario de la sonda Laurdan muestran variaciones no monotónicas de su
comportamiento, en función del contenido de colesterol, mostrando mínimos
en las propiedades medidas (constante dieléctrica y dinámica
molecular/hidratación), a las mismas concentraciones de colesterol a la cual se
presenta los máximos locales en la actividad de la enzima. Paralelamente los
resultados obtenidos por la banda de absorción infrarroja de los enlaces
carbonilos, indican que a estas concentraciones de colesterol existe un
máximo en la cantidad de grupos carbonilos "libres" de los lípidos (sin puentes
de hidrógeno). El conjunto de estos resultados nos permite postular que el
contenido de colesterol afecta la hidratación de la lamela, tanto en el corazón hidrofóbico como a nivel del esqueleto de glicerol, observándose un mínimo de
hidratación en las concentraciones mencionadas.
Paralelamente, los resultados obtenidos del estudio de los dominios
superficiales de la enzima por espectroscopia de fluorescencia de sondas
unidas covalentemente a la proteína, indican que en los estados de máxima
actividad existe una máxima hidratación de sus dominios superficiales y una
máxima movilidad del esqueleto proteico en la proximidad de las sondas. Los
estudios de absorción infrarroja de la enzima, realizados por la técnica de
ATR-FTIR muestran que la modificación del contenido de colesterol de las
vesículas produce cambios en la forma y corrimientos de la banda amida 1,
que indicarían cambios en su estructura secundaria. El desplazamiento
espectral de su máximo presenta un patrón de cambios definido, con máximos
de frecuencia en los estados de máxima actividad enzimática. De acuerdo a la
deconvolución de las bandas, en estos estados la proporción de estructuras
secundarias de la proteína son estadísticamente similares, mostrando
diferencias significativas, sin patrón definido a los otros contenidos de
colesterol.
El análisis de estos resultados se realizó en el contexto de la teoría de
súper red cuya hipótesis central postula que el colesterol induce la formación
de dos tipos de dominios segregados con distintas propiedades físicas. Los
dominios tendrían dimensiones submicrométricas y su proporción cambiaría
drásticamente a ciertas concentraciones críticas de colesterol, en las cuales a
proporción de dominios regulares es máxima. En estos estados existiría la
mayor proporción de superficies interdominios, lugar en el cual la enzima
tendría una máxima actividad.