Efecto del cobre y hierro sobre la expresión y actividad enzimática de las oxidasas multicobre del hongo basidiómicete phanerochaete chrysosporium.

Abstract

Los basidiomicetes como Phanerochaete chrysosporium son un grupo de hongos filamentosos capaces de degradar la lignina, un biopolimero de estructura y composición altamente compleja, presente en la pared celular de las plantas leñosas. Durante la degradación de la lignina estos microorganismos secretan al medio extracelular diversas enzimas oxidativas, las que están involucradas en el proceso ligninolítico. Estas enzimas, de manera inespecífica, generan radicales libres a partir de la oxidación de residuos aromáticos de la lignina, provocando la ruptura espontánea del esqueleto carbonado de este polímero. Una de las enzimas involucradas en la ligninolisis es una fenol oxidasa conocida como lacasa, proteína perteneciente a la familia de las oxidasas multicobre. Aunque la inspección de la base de datos del genoma de P. chrysosporium reveló la presencia de 5 secuencias que codifican para oxidasas multicobre, ninguna de éstas codifica para una lacasa. Cuatro de estos genes están agrupados en el genoma y se denominan de mcol a mco4. El quinto gen, conocido como fet3, codifica para una ferroxidasa convencional de membrana. Mediante análisis bioquímicos, estructurales y filogenéticos se demostró que MC01 es una ferroxidasa extracelular con una nula actividad fenol oxidasa, que dio origen a una nueva rama de la familia de las oxidasas multicobre, distinta de lacasas canónicas y ferroxidasas tipo Fet3. Sin embargo, la función fisiológica de esta enzima se desconoce. Estudios preliminares sugieren una posible regulación transcripcional, dependiente de hierro y cobre, de los genes que codifican para oxidasas multicobre. A nivel enzimático, existe evidencia que indica una potenciación, dependiente de hierro, de la actividad fenol oxidasa de MC01. Con el fin de profundizar el conocimiento sobre esta familia génica, en esta tesis se determinaron los niveles de transcrito de los genes que codifican para oxidasas multicobre en cultivos suplementados con cobre o hierro. Los resultados obtenidos permitieron demostrar que el cobre produce un aumento sólo en los niveles de transcrito de mcol y mco2, mientras que el hierro produce una disminución en los niveles de transcrito de mcol, mco2 y mco4. Respecto al efecto del cobre, se validó experimentalmente un sitio de regulación transcripcional para dicho metal (ACE) identificado en el promotor de mcol, junto con su respectiva proteína regulatoria (Pc-ACE1). Mediante ensayos de unión proteína-DNA, se caracterizó la actividad de unión a DNA del factor de transcripción mencionado al sitio ACE, así como su actividad transcripcional in vitro. Finalmente, mediante mutación sitio dirigida y posterior expresión heteróloga de MC01, se estudió su actividad ferroxidasa y su actividad fenol oxidasa dependiente de hierro. Los resultados permitieron concluir que el ácido glutámico 214 de MC01 es un residuo clave que participa tanto en la oxidación de hierro, como en la actividad fenol oxidasa dependiente de hierro. Ambas actividades enzimáticas ocurren en un único sitio activo de la enzima.