Tesis Doctorado
Análisis de nuevas estrategías basadas en silenciamiento génico para el control de enfermedades virales en plantas.
Autor
Fraile, Aurora
Universidad Politécnica de Madrid
Institución
Resumen
El silenciamiento génico postranscripcional es un mecanismo de degradación de
RNA dependiente de homología de secuencia, que actúa como un sistema natural de
defensa en plantas frente a infecciones virales. Se conoce además, que el RNA bicatenario
(dsRNA) constituye el inductor de esta respuesta de defensa adaptativa y altamente
conservada en la evolución. En este trabajo de Tesis se han abordado dos estrategias que
aunque diferentes, ambas se basan en la utilización de moléculas dsRNAs derivadas de
secuencias virales para interferir con la infección de los virus. La primera estrategia se basa
en la expresión de dsRNA de forma estable por transgenes que codifican la transcripción de
secuencias virales dispuestas en repetición invertida (IR). En este sentido, se han obtenido
líneas transgénicas de Nicotiana benthamiana en las cuales se ha introducido un transgén
que contiene una repetición invertida de la región 54k de la replicasa del virus del moteado
suave del pimiento (PMM0V). La expresión de esta construcción produjo la acumulación
estable en la planta de un transcrito de longitud correspondiente a la secuencia transgénica.
En ensayos de protección frente a PMM0V, cerca del 70% de estas lineas R0regeneradas
mostraron resistencia frente al virus. Por el contrario, construcciones dispuestas en
repetición directa, que codifican la misma región del virus pero sin capacidad de hibridar
intramolecularmente, mostraron resistencia al virus en tan solo un 6-20% de las plantas R 0
regeneradas. La resistencia a PMMoV estuvo asociada con la acumulación de pequeños
RNAs de 21 y 25 nts, característicos del PTGS, en un estadía previo a la inoculación viral.
Se ha caracterizado una línea R 2en homocigosis, 1R4#8, que expresa el RNA bicatenario.
Esta línea ha sido sometida a títulos crecientes de inóculo viral en la hoja y a una elevada y
continua presión de inóculo vía haces vasculares, mediante la utilización de injertos. En
todos los casos, las plantas transgénicas presentaron elevada resistencia (inmunidad) frente
al virus hasta el final del ciclo vital. Por otra parte, cuando plantas de esta línea transgénica
fueron inoculadas con tobamovirus con baja similitud nucleotídica con PMMoV-S, como TMV
o ToMV, éstas mostraron un fenotipo de susceptibilidad, sin embargo, cuando fueron
inoculadas con PMMoV-1, un tobamovirus con elevada similitud nucleotídica con PMMoV,
las plantas mostraron un fenotipo de completa resistencia, indicando esto la alta
especificidad del mecanismo que promueve la resistencia en estas plantas.
La segunda estrategia se presenta como una alternativa a la transformación genética
de plantas y se basa en la producción de dsRNAs derivados de secuencias virales en
bacterias. Previamente había sido demostrado que la inoculación conjunta de virus y dsRNA
derivado de secuencias virales producido in vitro, previene de manera específica la infección
viral en plantas. Con objeto de contar con grandes cantidades de dsRNA que pudieran ser
utilizadas en estudios de PTGS, así como para su potencial uso en el control de las enfermedades virales en plantas, se ha desarrollado un sistema de expresión inducible de
estas moléculas en bacteria. Los dsRNAs así expresados corresponden a diversas
secuencias genómicas derivadas de PMMoV, del virus de la sharka (PPV) y del virus Y de la
patata (PVY). Los dsRNAs purificados a partir de bacteria y co-inoculados con el virus
homólogo en plantas de N. benthamiana y Capsicum annuum, presentaron una
interferencia específica con la infección viral. Además, cuando extractos crudos de dsRNAs
obtenidos mediante el lisado de la bacteria por la Prensa Francesa, sin ningún paso
adicional de purificación, fueron co-inoculados con el virus homólogo o pulverizados sobre la
superficie foliar de las plantas, se observó que eran igualmente efectivos en la protección
viral, incluso cuando la pulverización se había efectuado varios días antes de la inoculación
del virus. No se obtuvo protección de las plantas por este método cuando la inoculación del
virus se realizó mediante el vector Myzus persicae. Sin embargo, cuando las moléculas
dsRNAs fueron expresadas transitoriamente en las plantas, se obtuvo una interferencia total
con la transmisión del virus por el vector, resultando las plantas protegidas de la infección
viral.