Caracterización de un canal de cloruro funciónalmente homologo a canales clc-2 en fotorreceptores de drosophila.

Abstract

Los canales de cloruro dependientes de potencial de la superfamilia CIC están ampliamente distribuídos en los seres vivos. Se han descrito genes homólogos en mamíferos, plantas, levaduras y bacterias. De acuerdo a sus características estructurales se han descrito nueve subfarnilias de canales CIC en mamíferos. Estas proteínas canal están distribuídos diferencialmente en diversos tejidos y están involucradas en importantes procesos fisiológicos. Es así como el funcionamiento defectuoso de la isoforma CIC- 1 presente en músculo esquelético determina miotonía y mutaciones en C1C-5 (expresado principalmente en riñón) lleva a la aparición de cálculos renales. Además, recientemente se ha reportado que los ratones knock-out para el canal CIC-2 presentan degeneración de la retina y del epitelio germinal. Este trabajo de Tesis estuvo centrado en la caracterización de un canal de cloruro presente en la membrana plasmática de los fotorreceptores de Drosophila, que no había sido descrito previamente en la literatura. En este estudio se registraron corrientes unitarias con la técnica de patch clamp en la modalidad inside-out (lado citoplasmático del canal expuesto al baño) y corrientes macroscópicas en la configuración de célula completa. Este canal de cloruro es de baja conductancia (4.4 pS registrado en 120 mM NaCI) y es activado por potenciales hiperpolarizantes. A través de registros en condiciones biiónicas se determinó su secuencia de permeabilidad aniónica relativa, la que corresponde a Cl = SCN > Bf » F. También se determinó que esta conductancia puede ser reversiblemente inhibida por bloqueadores de canales de cloruro como el zinc y antraceno, pero que no es afectada por DIDS. El conjunto de las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas de este canal sugieren que es funcionalmente homólogo a los canales de cloruro pertenecientes a la subfamilia CIC-2 de mamíferos. Complementariamente, se estudió la inmunoreactividad de la retina de Drosophila por análisis de Western blots empleando un anticuerpo anti CIC-2 de rata y se determinó que existe una proteína reactiva de una masa molecular similar a la reportada para las proteínas CIC-2. Los análisis de inmunohistoquí mica, empleando el mismo anticuerpo, revelaron proteínas reactivas en la membrana plasmática de los fotorreceptores (donde se registró el canal en estudio) y en la porción distal de sus axones en la lámina. Por otro lado, recientemente han surgido fuertes evidencias que sugieren la participación de ácidos grasos poliinsaturados como agonistas endógenos de las conductancias dependientes de luz en Drosophila. En este trabajo de Tesis se determinó que el ácido linolénico (LNA, 18:3 cis) puede modular la actividad del canal de cloruro presente en la membrana de los fotorreceptores de Drosophila a concentraciones micromolares. Esta activación por ácido linolénico se observó a nivel de canal único en parches aislados y en fotorreceptores intactos de la doble mutante trp,trpl (que carece de las dos conductancias dependientes de luz), donde se estudió selectivamente el efecto del LNA sobre la corriente macroscópica de cloruro. En cuanto a la participación de este canal de cloruro en la fisiología de los fotorreceptores de Drosophila, es posible que esté involucrado en la mantención del potencial de reposo, en la homeostasis de la concentración intracelular de cloruro y quizás en forma indirecta en la fototransducción.