Orientador: Stephen HyslopTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: Introdução: Bothrops atrox (jararaca-do-norte) é a principal causa de envenenamento ofídico na região amazônica. Vários estudos têm investigado a bioquímica desta peçonha, bem como os efeitos locais (dor, edema, hemorragia e mionecrose) que ela causa. Por outro lado, os efeitos sistêmicos têm sido menos estudados. Neste trabalho, investigamos as alterações hemodinâmicas causadas por esta peçonha em ratos anestesiados bem como os possíveis mediadores envolvidas nestas respostas. Métodos: Ratos machos Wistar (300-400 g) anestesiados com isoflurano foram canulados para o registro da pressão arterial (carótida) e para a administração intravenosa (i.v.) de diferentes substâncias (peçonha, antagonistas e inibidores) (veia femoral esquerda). Em alguns experimentos, houve administração intramuscular (i.m.) de peçonha. A frequência respiratória foi determinada manualmente e o ECG foi monitorado via eletrodos introduzidos nas patas dianteiras e traseira. Em intervalos pré-estabelecidos, foram coletadas amostras de sangue arterial para análise bioquímica e determinação da cinética da peçonha. Ao término dos experimentos, foram coletados tecidos (rim, pulmão, coração, fígado e músculo) para análise histológica. A capacidade do antiveneno botrópico comercial em neutralizar algumas atividades enzimáticas e as alterações hemodinâmicas foi avaliada pré-incubando-se a peçonha com antiveneno antes de testar a atividade residual. A peçonha também foi fracionada por gel filtração e os picos testados quanto à sua atividade sobre a pressão arterial. Resultados: A peçonha (0,4 mg/kg, i.v.) causou hipotensão imediata (máxima aos 5 min) seguida por recuperação nos 20 min seguintes; não houve alteração na frequência cardíaca, ECG ou frequência respiratória, e não houve mortes (sobrevida até o final do experimento: 120 min). Uma dose maior (0,7 mg/kg, i.v.) causou hipotensão progressiva, bradicardia e falência respiratória, com morte de todos os ratos (n=6) em 20±4 min. A administração intramuscular (músculo gastrocnêmio) de peçonha (4 mg/kg) mostrou um perfil hemodinâmico semelhante àquele observado com a dose menor i.v. A análise histológica mostrou que a dose menor i.v. causou trombose e hemorragia pulmonares, além de dano renal (descamação epitelial, deposição proteica e microaneurismos); houve proteinúria e hemoglobinúria em urina coletada no final do experimento. Não houve alteração histológica nos outros tecidos examinados (fígado, coração). Quando administrada i.m. ou i.v. (dose maior), a peçonha causou apenas trombose pulmonar. Já a administração i.m. causou hemorragia e necrose locais, e proteinúria. Houve aumento significativo de creatinoquinase (CK) aos 120 min após injeção da peçonha por via i.v. (dose menor) ou i.m., porém só foi observado aumento da lactato desidrogenase (LDH) com a peçonha injetada por via i.v.; não houve alteração na concentração de glicose circulante em nenhum grupo. A peçonha injetada i.v. mostrou uma cinética bifásica, enquanto a administração i.m. resultou em absorção contínua durante o experimento. Com ambas as vias, ao final do experimento houve detecção de peçonha por ELISA na urina. O antiveneno (razão peçonha:antiveneno de 5:1 e 5:10) injetado 1 min após a peçonha não atenuou a hipotensão, mas reduziu o dano renal (proteinúria) e o aumento de CK. A pré-incubação da peçonha com antiveneno nas proporções indicadas acima inibiu as atividades amidolítica, PLA2 e proteolítica da peçonha. O pré-tratamento dos ratos com sildenafil (inibidor da PDE5), atenolol (antagonista ?1-adrenérgico), atropina (antagonista muscarínico não seletivo), doxiciclina (inibidor de metaloprotease) ou infliximabe (anticorpo contra TNF?) não afetaram a hipotensão. Por outro lado, o pré-tratamento com L-NAME ou L-NMMA (inibidores da enzima óxido nítrico sintase) e ODQ (inibidor da guanilil ciclase solúvel) causou perfil de hipotensão semelhante àquela observada com a dose maior de peçonha i.v., e aumentou a letalidade da peçonha. Estes ratos não apresentaram hemorragia nem hemoglobinúria, no entanto, foram observados presença de trombos de forma semelhante aos ratos tratados somente com a peçonha. O pré-tratamento com indometacina (inibidor não seletivo da ciclooxigenase) atenuou a hipotensão inicial (primeiro minuto pós-peçonha) e melhorou a recuperação subsequente. Já o HOE-140 (antagonista dos receptores B2 da bradicinina) e o pBPB (inibidor da PLA2) atenuaram ou aboliram a hipotensão, respectivamente. A cromatografia por gel filtração resultou em cinco picos: pico I causou hipotensão transitória, aumento de CK e hemoglobinúria, enquanto que o pico II reproduziu o perfil de hipotensão visto com a peçonha, sem aumentar o CK, mas causou hemorragia; os outros picos (III, IV e V) não mostraram ação significativa sobre a pressão arterial. Conclusão: Baseado nos resultados deste trabalho, concluímos que em ratos anestesiados a peçonha de B. atrox injetada i.v. ou i.m. causa hipotensão, sem alterar os parâmetros cardíacos (frequência e ECG) ou respiratórios. A hipotensão envolve a ação de PLA2 e cininas, enquanto a formação do NO exerce efeito protetor contra a redução na pressão arterial e a letalidade da peçonha. O antiveneno botrópico polivalente não é eficaz em proteger contra as alterações hemodinâmicas observadasAbstract: Introduction: Bothrops atrox (jararaca-do-norte) is the main cause of snakebite in the Amazon region. Various studies have examined the biochemical aspects of this venom, as well as local effects such as pain, edema, hemorrhage and myonecrosis that this species causes. In contrast, the systemic effects caused by this venom have been less studied. In this work, we investigated the hemodynamic alterations caused by B. atrox venom in anesthetized rats, as well as the possible mediators involved in this response. Methods: Male Wistar rats (300-400 g) anesthetized with isoflurane were cannulated for arterial blood pressure measurements (carotid artery) and for the intravenous (i.v., femoral vein) administration of test substances (venom, antagonists and inhibitors). In some experiments, venom was injected intramuscularly (i.m.). Respiratory rate was determined manually and ECG was monitored using conventional electrodes. At pre-established intervals, arterial blood was drawn for biochemical analyses and determination of venom kinetics. At the end of the experiments, tissue samples were collected from heart, liver, lung and muscle for histological analysis. The ability of commercial bothropic antivenom to neutralize selected venom enzymatic activities and the venom-induced hemodynamic alterations was assessed by preincubating venom with antivenom prior to testing for residual activity. Venom was also fractionated by gel filtration and the resulting peaks were screened for their activity on blood pressure. Results: Venom (0.4 mg/kg, i.v.) caused immediate hypotension (maximal at 5 min) followed by recovery over 20 min; there were no changes in heart rate, ECG or respiratory rate and no deaths (survival for up to 120 min post-venom). A higher dose of venom (0.7 mg/kg, i.v.) caused progressive hypotension, bradycardia and respiratory failure, with all rats (n=6) dying in 20±4 min. A similar hemodynamic profile to the lower dose of venom i.v. was seen with venom (4 mg/kg) given i.m. (gastrocnemius muscle). Venom given i.v. (lower dose) caused pulmonary thrombosis and hemorrhage, in addition to renal damage (epithelial desquamation, deposition of protein and microaneurysms); proteinuria and hemoglobinúria were observed in urine collected at the end of the experiment. Venom given i.m. or i.v. (higher dose) caused only pulmonary thrombosis. Renal damage (epithelial desquamation, proteinuria and hemoglobinuria) was seen with venom i.v. (0.4 mg/kg); venom given i.m. caused local hemorrhage and necrosis, and proteinuria. There were no histological alterations in the other tissues examined (heart, liver). When administered i.m. or i.v. (higher dose), the venom caused only pulmonary thrombosis; with i.m. injection, local hemorrhage and necrosis were also observed, as well as proteinuria. There was a significant increase in creatine kinase (CK) 120 min post-venom after administration i.v. (lower dose) or i.m., whereas an increase in lactate dehydrogenase (LDH) was seen only with venom injected i.v.; there were no changes in the circulating glucose levels in any group. Venom given i.v. showed biphasic kinetics while venom given i.m. showed constant absorption from the injection site. With both routes of administration, venom was detected by ELISA in urine samples collected at the end of the experiment. Commercial bothropic antivenom (venom:antivenom ratios of 5:1 and 5:10) given 1 min after venom did not neutralize the hypotension but attenuated the renal damage (proteinuria) and venom amidolytic, PLA2 and proteolytic activities. Pretreatment of rats with sildenafil (PDE5 inhibitor), atenolol (?1-adrenergic antagonist), atropine (non-selective muscarinic antagonist), doxycycline (metalloprotease inhibitor) and infliximab (antibody to TNF?) did not attenuate venom-induced hypotension. In contrast, pretreatment with L-NAME or L-NMMA (nitric oxide synthase inhibitors) and ODQ (soluble guanylyl cyclase inhibitor) potentiated hypotension and venom lethality. Pretreatment with indomethacin (non-selective cyclooxygenase inhibitor) attenuated the initial hypotension (1 min post-venom) and enhanced recovery, whereas HOE-140 (bradykinin B2 receptor antagonist) and pBPB (PLA2 inihibitor) greatly attenuated and abolished the hypotension, respectively. Gel filtration chromatography of B. atrox venom resulted in five peaks: peak I caused transient hypotension, an increase in CK and hemoglobinuria; peak II reproduced the venom profile of hypotension without an increase in CK, but caused hemorrhage. Conclusion: The results described here indicate that the i.v. or i.m. injection of B. atrox venom in anesthetized rats causes hypotension without changing the cardiac (heart rate and ECG) or respiratory parameters. The hypotension involves the action of venom PLA2 and kinins, with nitric oxide formation exerting a protective effect against changes in blood pressure and venom lethality. Commercial polyvalent bothropic antivenom was ineffective in protecting against the venom-induced hemodynamic alterationsDoutoradoFarmacologiaDoutora em Farmacologia01-P-4360/2010, 01-P-3887/2011, 01-P-2162/2012, 01-P-4522/2013 e 01-P-3488/2014CAPES