La PEGilación es la unión covalente de una proteína a una o varias cadenas de poli(etilen glicol) (PEG). Esta técnica ha sido utilizada para mejorar las propiedades fisicoquímicas de varias proteínas utilizadas como drogas terapéuticas. Durante la reacción de PEGilación se forman diferentes bioconjugados variando en el nÚmero de cadenas de PEG añadidas y el sitio de unión. La purificación de proteínas PEGiladas consiste en remover todas las especies que no formen parte del producto de interés, lo que involucra dos retos principalmente: 1) la separación de las proteínas PEGiladas del resto de los productos de la reacción y 2) el sub-fraccionamiento de las proteínas PEGiladas en base al grado de PEGilación y a los isómeros posicionales. Los métodos cromatográficos han sido frecuentemente utilizados para resolver las mezclas de la reacción de PEGilación, la cromatografía de exclusión molecular (SEC) y de intercambio iónico (IEC) son las más utilizadas. Comparativamente muy poco trabajo ha sido realizado para explorar otras técnicas como la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). Por otro lado, una revisión detallada de la literatura muestra que las técnicas no-cromatográficas (ultrafiltración, sistemas de dos fases acuosas, electroforesis, etc.) son básicamente utilizadas para la caracterización de los productos de la reacción de PEGilación. Dentro de este contexto, en este trabajo se presenta el estudio de la separación de los productos de la reacción de PEGilación de RNasa A utilizando diferentes condiciones y tipos de resinas en HIC. Se demuestra que el uso de un soporte ligeramente hidrofóbico como CH sefarosa 4B cubierta con Tris, puede ser utilizado como una alternativa para la separación de las proteínas PEGiladas de la proteína nativa. Adicionalmente, los productos de la reacción de PEGilación fueron separados utilizando tres resinas con diferente grado de hidrofobicidad: butil, octil y fenil sefarosa. Se evaluaron los efectos del tipo de resina, el tipo y la concentración de sal (sulfato de amonio y NaCl) y la longitud del gradiente sobre el proceso de separación. Se calcularon la pureza y el rendimiento empleando el modelo de platos. Bajo todas las condiciones analizadas, la proteína nativa es completamente separada de las especies PEGiladas. Las mejores condiciones para la purificación de RNasa A monoPEGilada se dan cuando se utiliza la resina butil sefarosa, sulfato de amonio 1M y un gradiente de elución de 35 CVs. Con esto es posible obtener un rendimiento del 85% y una pureza del 97%. Este proceso representa una alternativa viable para la separación de proteínas PEGiladas.