| dc.description | Os componentes de venenos de serpentes são moléculas com potencial de bioprospecção nas
áreas das Ciências Biomédicas. Dentre esses componentes, as proteínas L-aminoácido oxidases
(LAAOs) são responsáveis por efeitos como atividades antimicrobianas em bactérias, fungos,
vírus e parasitas, indução de edema, efeitos citotóxicos, coagulantes e anticoagulantes,
hemorrágicos e ativação de neutrófilos. Ao entrar em contato com o agente agressor, o
neutrófilo realiza o processo de fagocitose, que juntamente com a formação das espécies
reativas do oxigênio (EROs) pelo complexo da NADPH oxidase ativado pela via da PKC,
possui a finalidade de degradar patógenos. O complexo da NADPH oxidase é composto por
proteínas citosólicas (p40phox, p47phox e p67phox), proteínas de membrana (p22phox e gp91phox) e
por uma proteína de sinalização, a Rac. Com isso, o objetivo deste trabalho foi dar continuidade
a caracterização funcional da LAAO isolada do veneno da serpente Calloselasma rhodostoma
sobre a ativação de neutrófilos humanos, com ênfase na participação do complexo da NADPH
oxidase. Para isso, foi obtido sangue periférico humano de doadores e os neutrófilos isolados
por gradiente de densidade. As células foram incubadas com tampão-fosfato salina (PBS,
controle negativo), acetato de forbol miristato (PMA 500 ng/mL, controle positivo), LAAO ou
LAAO inativada (50 μg/mL). Após ultracentrifugação celular para separação de frações
citosólicas e de membrana, separação por SDS-PAGE e transferência para membrana de PVDF
em ensaios de Western blot, a expressão proteica dos componentes da NADPH oxidase foram
visualizadas na presença de anticorpos específicos para cada componente (p40phox, p47phox,
p67phox, gp91phox e Rac1,2,3), além das PKCs subunidade α (PKC-α) e sua forma fosforilada
(p-PKC-α/β II), das ciclooxigenases (COX-1 e COX-2) e fosfolipases A2 citosólicas (cPLA2)
na sua forma nativa e fosforilada (p-cPLA2). Os resultados obtidos mostraram que houve
expressão das proteínas p40phox, p47phox, p67phox e Rac nas frações de membrana dos neutrófilos,
demonstrando a migração dos componentes citosólicos para a porção de membrana, evento que
ocorre quando o complexo é ativado. O Western blot para a proteína de membrana gp91phox
mostrou reatividade para as condições testadas na fração de membrana. A ativação da NADPH
oxidase se dá pela via da PKC, pois houve expressão dessa proteína tanto na sua forma nativa,
quanto fosforilada. Além disso, observou-se que a LAAO induziu a expressão da PLA2
citosólica na forma fosforilada e de COX-1, porém não houve expressão da COX-2. Tomados
em conjunto, os dados obtidos permitem concluir que a LAAO foi capaz de ativar o complexo
NADPH oxidase de neutrófilos humanos para produção de EROs com a participação da PKC.
A LAAO induziu a ativação e a fosforilação da cPLA2, contribuindo para a expressão da COX-
1. Por outro lado, a LAAO na sua forma inativada não induziu a ativação do complexo. Assim,
em neutrófilos a produção de EROs é desencadeada pela ativação do complexo da NADPH
oxidase induzida pela LAAO e não pela atividade intrínseca da enzima. | |
