O presente trabalho relata o desenvolvimento de um biossensor amperométrico para detecção do vírus da Hepatite C (HCV) por meio da reação de hibridização do DNA imobilizado na superfície do eletrodo com o DNA complementar proveniente de amostras de soro de pacientes. Neste dispositivo, a reação da enzima peroxidase com o substrato peróxido de hidrogênio e com o mediador de elétrons ácido 5-aminossalicílico é utilizada como marcadora da reação de hibridização. Estudos eletroquímicos e espectrofotométricos foram empregados na investigação do produto da oxidação do mediador pela enzima, sugerindo-se que este seja um complexo formado entre o Fe4+ presente no grupo heme da peroxidase e o grupo NH2 do ácido 5-aminossalicílico. Este complexo sofre redução na superfície do eletrodo resultando na resposta analítica do sistema proposto. Na construção do biossensor, os eletrodos de ouro, obtidos a partir de CDs graváveis denominados CDtrodos, foram modificados com monocamadas auto-organizadas de ácido lipóico 1,0 x 10-3 mol L-1 por 120 minutos. Estudos quimiométricos, por meio do planejamento fatorial completo e fracionado, foram aplicados para obtenção das melhores condições de imobilização das biomoléculas, compreendendo a concentração e o tempo de incubação dos CDtrodos nas soluções da proteína estreptavidina, da sonda de DNA específica para o HCV genótipos 1 e 3, do DNA complementar e do conjugado avidina-peroxidase, marcador da reação de hibridização. O valor de cut-off foi determinado como sendo de –0,599 A e biossensor foi então aplicado em amostras positivas para HCV. Os resultados mostraram que o biossensor desenvolvido é adequado para aplicação em amostras dos genótipos 1 e 3, os quais prevalecem no Brasil.This work presents the development of an amperometric biosensor for the detection of Hepatitis C virus (HCV) through the reaction of hybridization of DNA immobilized on the electrode surface with the complementary DNA (c-DNA) from serum samples of patients. In this device, the reaction of the enzyme peroxidase with the substrate hydrogen peroxide and with the electron mediator 5-aminossalicylic acid is used as hybridization label. Electrochemical and spectrophotometric studies were carried out to investigate the oxidation product of the mediator by the enzyme, suggesting that one is a complex formed between the Fe4+ of heme peroxidase group and NH2 group of 5-aminossalicylic acid. This complex undergoes reduction in the electrode surface resulting in the analytical response of the proposed system. For the construction of the biosensor, the gold electrodes, obtained from recordable CDs namely CDtrodes, were modified with self-assembled monolayers of lipoic acid 1.0 x 10-3 mol L-1 for 120 minutes. Chemometric studies, through the full and fractional factorial design, were applied to obtain the best conditions for the biomolecules immobilization, including the concentration and the incubation time of CDtrodes in the solutions of the protein streptavidin, the DNA probe specific for the HCV genotypes 1 and 3, c-DNA and the avidin-peroxidase conjugate, label of the reaction of hybridization. The cut-off value was determined as -0599 A and the biosensor was applied for HCV positive samples. The results showed that the developed biosensor is suitable for application in samples of genotypes 1 and 3, which are those that prevail in Brazil.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)