Leishmania infantum NTPDase1 and 2: obtention of overexpressing and null mutants and their functional characterization

NTPDase 1 e 2 de Leishmania infantum: obtenção de mutantes nulos e superexpressores e sua caracterização funcional

dc.contributorFietto, Juliana Lopes Rangel
dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/8925352603877906
dc.contributorBressan, Gustavo Costa
dc.contributorVasconcellos, Raphael de Souza
dc.contributorMendes, Thiago Antônio de Oliveira
dc.contributorLamego, Márcia Rogéria
dc.creatorSilva, Walmir da
dc.date2023-03-28T12:34:03Z
dc.date2023-03-28T12:34:03Z
dc.date2020-12-17
dc.date.accessioned2023-09-27T21:33:59Z
dc.date.available2023-09-27T21:33:59Z
dc.identifierSILVA, Walmir. Leishmania infantum NTPDase1 and 2: obtention of overexpressing and null mutants and their functional characterization.2020. 132 f. Tese (Doutorado em Bioquímica Aplicada) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa.2020.
dc.identifierhttps://locus.ufv.br//handle/123456789/30600
dc.identifier.urihttps://repositorioslatinoamericanos.uchile.cl/handle/2250/8962715
dc.descriptionLeishmaniasis is a serious public health problem mainly in tropical countries. They are considered neglected tropical diseases with approximately 900 thousand new cases per year according to WHO, 2019. The most severe form of the disease is visceral Leishmaniasis, which in the American continent is caused by the species Leishmania infantum. Although it has been described many virulence factors of this parasite, NTPDases have been showed to have a particular role not only in the infection of the parasite to host cells but also in the initial mechanisms of adhesion. NTPDases are described in several pathogenic organisms belonging to the Trypanosomatidae family. They hydrolyze pro-inflammatory ATP and ADP to their monophosphate form AMP, which in turn can be hydrolyzed by the 5'nucletidase to the anti-inflammatory Adenosine (ado), thus having the potential to subvert and prevent host defense mechanisms. In this thesis, we review Leishmania NTPDases biological roles and proposed their potential use as a target molecule for more efficient therapies against leishmaniasis. In addition, for the first time, we used genetic approaches to establish Leishmania infantum NTPDases null mutants using CRISPR / Cas9 and overexpressing using Conventional Homologous Recombination. We have successfully obtained clones overexpressing NTPDases. eGFP fused LiNTPDase2 at the C-terminal portion showed nuclear and kinetoplast localization. Furthermore, there were no metabolic changes in the clones overexpressing these enzymes. On the other hand, to obtain null mutants we initially obtained a clone of Leishmania infantum JPCM5 expressing SpCas9. Using these clones, we were able to obtain null mutants for NTPDases 1 and 2. However, the double knockout was lethal for Leishmania, evidencing the importance of at least one of these enzymes for the parasite's survival. The null mutants obtained showed a modified metabolism and growth, however, when supplemented with adenine and guanine, the phenotype was reversed. Analysis of gene expression revealed that in both mutants there was a compensation in the expression of the other isoform that was not deleted. In the adhesion assays, only the null mutant clones showed decreased adhesion while the mutant overexpressing NTPDase2 showed increased adhesion. LiNTPDase1 ko clones showed no differences indicating that it has no role in adhesion. On the other hand, there was a decrease in macrophage infection by null mutants for LiNTPdase1 and 2, indicating their involvement in this mechanism. This report corroborates data from Nitric Oxide assay that showed to be elevated in null mutants indicating their inhibition in the wild type parasite. Enzyme activity using ATP, UDP, and AMP was also performed, but only clones overexpressing LiNTPDase2 showed an increase. Thus, in this thesis, we showed the involvement of LiNTPdases in adhesion, infection, and modulation of the initial response of the macrophage during the initial stages of infection. Keywords: NTPDases. Leishmania Homologous Recombination. infantum. Trypanosomatids. CRISPR/Cas9.
dc.descriptionLeishmanioses são consideradas um grave problema de saúde pública principalmente em países tropicais. São doenças negligenciadas com aproximadamente 900 mil novos casos anuais segundo a WHO, 2019. A Leishmaniose visceral é a forma mais grave da doença e no continente americano é causada pela espécie Leishmania infantum. Dos diversos fatores de virulência deste parasito as NTPDases tem sido descritas com um importante papel não somente na infecção do parasita a células hospedeira, mas também nos mecanismos iniciais de adesão. NTPDases são descritas em diversos organismos patogênicos. Elas hidrolisam de ATP e ADP pró-inflamatórios a sua forma monofosfatada AMP, que por sua vez pode ser hidrolisado pela 5’-nucletidase a Adenosina (ado) anti- inflamatória, tendo assim, o potencial de subverter e evitar mecanismos de defesa do hospedeiro. Neste trabalho, nós revisamos os papeis biológicos das NTPDases de Leishmania e propomos seu potencial uso como molécula alvo de terapêuticas mais eficientes contra as leishmanioses. Além disso, pela primeira vez nós utilizamos abordagens genéticas para estabelecermos mutantes nulos usando CRISPR/Cas9 e mutantes superexpressores usando recombinação homologa convencional para as NTPDases 1 e 2 de Leishmania infantum. Obtivemos com sucesso clones superexpressores das NTPDases. LiNTPDase2 fundida a eGFP na porção C-terminal mostrou localização nuclear e cinetoplastica. Além disso não houve modificação na taxa de crescimento nos clones superexpressores destas enzimas. Por outro lado, para obtenção de mutantes nulos inicialmente obtivemos um clone de Leishmania infantum JPCM5 expressando a SpCas9. Utilizando estes clones fomos capazes de obter mutantes nulos para as NTPDases 1 e 2. Contudo, dupla deleção foi letal para a Leishmania, evidenciando a importância de pelo menos uma destas enzimas para a sobrevivência do parasita. Os mutantes nulos obtidos mostraram um metabolismo e crescimento modificado, porém quando suplementados com adenina e guanina, o fenótipo foi revertido. Analise de expressão genica revelou que em ambos os mutantes houve uma compensação na expressão da outra isoforma que não foi deletada. Nos ensaios de adesão somente os clones mutantes nulos mostraram diminuição da adesão enquanto o mutante superexpressor da NTPDase2 mostrou aumento da adesão. Mutante nulo da LiNTPDase1 não mostrou diferença indicando que ela não possui papel na adesão. Por outro lado, houve diminuição da infecção de macrófagos por mutantes nulos paras as LiNTPdase1 e 2 indicando seus envolvimentos neste mecanismo. Estes dados corroboram os dados de mensuração de Oxido Nítrico que se mostraram elevados nos mutantes nulos indicando a sua Inibição no parasita selvagem. A atividade das enzimas usando ATP, UDP e AMP também foram realizadas, porém somente os clones superexpressores da LiNTPDase2 mostraram aumento. Desta forma, neste trabalho nos mostramos o envolvimento da LiNTPdases na adesão, infecção e modulação da resposta inicial do macrófago durante as etapas iniciais da infecção. Palavras-chave: NTPDases. Leishmania infantum. Trypanosomatideos. CRISPR/Cas9. Recombinação Homologa.
dc.formatapplication/pdf
dc.languageeng
dc.publisherUniversidade Federal de Viçosa
dc.publisherBioquímica Aplicada
dc.rightsAcesso Aberto
dc.subjectEnzimas
dc.subjectLeishmania infantum
dc.subjectTrypanosomatideae
dc.subjectRecombinação de homólogos
dc.subjectRepetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Espaçadas
dc.subjectBiologia Molecular
dc.titleLeishmania infantum NTPDase1 and 2: obtention of overexpressing and null mutants and their functional characterization
dc.titleNTPDase 1 e 2 de Leishmania infantum: obtenção de mutantes nulos e superexpressores e sua caracterização funcional
dc.typeTese


Este ítem pertenece a la siguiente institución