A S(+) cetamina é um fármaco amplamente utilizado na medicina para induzir anestesia e a associação com midazolam é empregada para minimizar seus efeitos adversos. Associações medicamentosas podem resultar em interações farmacocinéticas e a disponibilidade de métodos bioanalíticos para a determinação da cetamina em plasma constitui ferramenta útil para a avaliação do perfil cinético do fármaco administrado isoladamente ou em associação. O presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento e validação de um método analítico para determinação da cetamina em plasma por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e a investigação do perfil farmacocinético da cetamina em quatro cães hígidos da raça Beagle. A S(+) cetamina (10mg/kg) foi administrada pela veia cefálica em dose única isoladamente (protocolo I) ou associada ao midazolam (0.2mg/kg) (protocolo II) em estudo cruzado com intervalo de uma semana para washout. Amostras seriadas de sangue foram coletadas no intervalo de oito horas e analisadas por HPLC para a avaliação do perfil farmacocinético utilizando modelo bicompartimental. O método bioanalítico apresentou limites de confiança aceitáveis para sua aplicação em estudos de farmacocinética e os parâmetros área sob a curva (ASC0-8), volume de distribuição (Vd), clearance total (Clt), meia vida de eliminação (t/12 ß), constante de eliminação (ß), meia vida de distribuição (t1/2α) e constante de distribuição (α) não mostraram diferenças estatísticas significativas entre os grupos (p < 0.05, Wilcoxon). Os resultados obtidos sugerem que a redução dos efeitos colaterais da cetamina decorrente do uso da associação cetamina-midazolam não está relacionada a alterações no perfil farmacocinético da cetamina.S(+)-ketamine is a drug widely used in human and veterinary medicine to induce anesthesia and midazolam has been co-administered with S(+)-ketamine to avoid adverse effects. Such drug associations can result in pharmacokinetic interactions and an analytical method to measure plasma concentrations of ketamine would be an useful tool to study the pharmacokinetic profile of a drug administered alone or in association. In the present work a method based on HPLC was developed and validated for the determination of ketamine in plasma samples. The pharmacokinetic parameters of S(+) ketamine administered alone or in combination with midazolam to four healthy female beagle dogs were also investigated. S(+)-ketamine (10mg/kg) was injected IV (cephalic vein) alone (protocol I) or combined with midazolam (0.2mg/kg) (protocol II) in a crossover design with a washout period of seven days. Blood samples were collected before and up to eight hours after dosing. Plasma concentrations of S(+)- ketamine were analyzed by HPLC/UV and the main pharmacokinetic parameters were derived from a bicompartmental model. The bioanalytical method presented acceptable confidence limits for application in pharmacokinetic studies and the parameters obtained, area under curve (AUC0-8), volume of distribution (Vd), total clearance (Clt), elimination half-life (t1/2), elimination rate (β), distribution half-live (t1/2α) and distribution rate (α) did not show statistically significant differences between the groups (P < 0.05, Wilcoxon's test). The S(+)-ketamine-midazolam combination has been used to reduce the dissociative side effects of kelatamine, such as excitement and catalepsy. The present results suggest that this feature is not related with pharmacokinetic alteration of the S(+)-ketamine.