Diferenciação de células T reguladoras tímicas em camundongos geneticamente mutantes em WASp

dc.contributorAlmeida, Vinícius Cotta de
dc.contributorBonomo, Adriana César
dc.creatorFontes, Larissa Vasconcelos
dc.date2020-09-08T20:32:17Z
dc.date2020-09-08T20:32:17Z
dc.date2020
dc.date.accessioned2023-09-26T23:45:50Z
dc.date.available2023-09-26T23:45:50Z
dc.identifierFONTES, Larissa Vasconcelos. Diferenciação de células T reguladoras tímicas em camundongos geneticamente mutantes em WASp. 2020. 102 f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e Molecular) - Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2020.
dc.identifierhttps://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/43264
dc.identifier.urihttps://repositorioslatinoamericanos.uchile.cl/handle/2250/8893957
dc.descriptionA proteína da síndrome de Wiskott-Aldrich (WASp) regula a dinâmica de rearranjos do citoesqueleto de actina e a função das células hematopoiéticas. Mutações no gene WAS levam a duas síndromes de imunodeficiência diferentes: a Síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS), causada por mutações de perda de função na WASp, e a neutropenia ligada ao X (XLN), causada por mutações de ganho de função. Foi demonstrado que os pacientes com WAS e XLN carregam várias anormalidades nas atividades linfocitárias. Curiosamente, mostramos anteriormente que a inativação de WASp em camundongos ("Wasp-knockout"-WASp-KO) resulta em número reduzido de células T reguladoras (Treg) no timo e na periferia. Entretanto, ainda não se sabe como a WASp constitutivamente ativa afeta a função das células Treg. Neste projeto, avaliamos o impacto das mutações em WASp na diferenciação de células Treg no timo de camundongos WASp-KO e de camundongos XLN (knock-in para mutações presentes na XLN). As células do timo de camundongos WT, WASp-KO e XLN foram analisadas por citometria de fluxo para avaliação dos timócitos, células B e células dendríticas. Para avaliar se as células provenientes de camundongos WASp-KO e XLN eram capazes de se diferenciar em células Treg, isolamos células CD4 SP e cultivamos com diferentes combinações de estímulos, como IL-2, TGF-\03B2, anti-CD3 e anti-CD28, por 12 a 72 horas, marcadas ou não com CFSE para rastrear células em proliferação Nossos resultados mostram que o timo dos animais WASp-KO apresenta diminuição significativa de células Treg, e os animais com mutação I296T-WASp apresentam leve diminuição dessas células. Quando comparadas aos camundongos WT, as células B tímicas estão diminuídas nos camundongos WASp-KO. Além disso, usando ensaios de diferenciação in vitro, descobrimos que timócitos CD4 SP de camundongos WASp-KO mostram diferenciação reduzida para células Treg. Apesar desse defeito, as células CD4 SP deficientes em WASp apresentam sinalização eficiente após estimulação com IL-2 e TGF-\03B2, medida pela regulação positiva da expressão de fosfo-Stat5 e fosfoSmad2/3, respectivamente. Embora as células obtidas dos camundongos WASp-KO tenham regulado positivamente o fator de transcrição Foxp3, elas não proliferaram, levando a um número menor de células Treg Foxp3+. Curiosamente, as células CD4 SP dos animais XLN proliferaram mais rapidamente quando comparadas às células do animal WT, tendo uma maior fração das células XLN Foxp3-, que pode ser causada pela rápida proliferação. Nós fornecemos evidências de que o timo de camundongos mutantes em WASp apresentou alterações em subpopulações de timócitos e de outras células tímicas. Por fim, esses resultados mostram que diferentes mutações em WASp afetam a diferenciação das células Treg de maneira bastante distinta, sugerindo um papel central da WASp durante o desenvolvimento das células T.
dc.descriptionThe Wiskott-Aldrich syndrome (WASp) protein regulates the dynamics of actin cytoskeleton rearrangements and the function of hematopoietic cells. Mutations in the WAS gene lead to two different immunodeficiency syndromes: Wiskott-Aldrich Syndrome (WAS), caused by loss-of-function mutations in WASp, and X-linked neutropenia (XLN), caused by gain-of-function mutations. It has been shown that patients with WAS and XLN carry various abnormalities in lymphocyte activities. Interestingly, we showed earlier that the inactivation of WASp in mice ("Wasp-knockout" -WASp-KO) results in a reduced number of regulatory T cells (Treg) in the thymus and in the periphery. However, it is not yet known how constitutively active WASp affects the function of Treg cells. In this project, we evaluated the impact of WASp mutations on the differentiation of Treg cells in the thymus of WASpKO mice and XLN mice (knock-in for XLN mutations). The thymus cells of WT, WASp-KO and XLN mice were analyzed by flow cytometry to evaluate thymocytes, B cells and dendritic cells. To assess whether cells from WASp-KO and XLN mice were able to differentiate into Treg cells, we isolated CD4 SP cells and cultured with different combinations of stimuli, such as IL-2, TGF-\03B2, anti-CD3 and antiCD28, for 12 to 72 hours, labeled or not with CFSE to track proliferating cells Our results showed that WASp-KO have a significant decrease in Treg cells, and animals with I296T-WASp mutation have a slight decrease in these cells. When compared to WT mice, thymic B cells are decreased in WASp-KO mice. In addition, using in vitro differentiation assays, we found that CD4 SP thymocytes from WASpKO mice show reduced differentiation for Treg cells. Despite this defect, WASp-deficient CD4 SP cells present efficient signaling after stimulation with IL-2 and TGF-\03B2, measured by the positive regulation of the expression of phospho-Stat5 and phospho-Smad2/3, respectively. Although the cells obtained from the WASp-KO mice have positively regulated the Foxp3 transcription factor, they have not proliferated, leading to a smaller number of Foxp3+Treg cells. Interestingly, the CD4 SP cells from XLN animals proliferated more quickly when compared to WT cells, having a larger fraction of XLN Foxp3- cells, which can be the result of rapid proliferation. We provide evidence that the thymus of WASp mutant mice showed changes in subpopulations of thymocytes and other thymic cells. Finally, these results show that different mutations in WASp affect the differentiation of Treg cells in different ways, suggesting a central role for WASp during the development of T cells.
dc.formatapplication/pdf
dc.languagepor
dc.rightsopen access
dc.subjectLinfócitos T Reguladores
dc.subjectTimo
dc.subjectProteína da Síndrome de Wiskott-Aldrich
dc.subjectDiferenciação Celular
dc.subjectLinfócitos T Reguladores
dc.subjectTimo
dc.subjectProteína da Síndrome de Wiskott-Aldrich
dc.subjectDiferenciação Celular
dc.titleDiferenciação de células T reguladoras tímicas em camundongos geneticamente mutantes em WASp
dc.typeThesis


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