| dc.contributor | Alves, Carlos Roberto | |
| dc.contributor | Cruz, Alda Maria da | |
| dc.contributor | Faria, Suzana Corte Real | |
| dc.contributor | Bourguignon, Saulo Cabral | |
| dc.contributor | Silva, Valmir Laurentino | |
| dc.creator | Gomes, Cinthia Bernardes | |
| dc.date | 2017-08-22T19:31:49Z | |
| dc.date | 2017-08-22T19:31:49Z | |
| dc.date | 2017 | |
| dc.date.accessioned | 2023-09-26T22:54:35Z | |
| dc.date.available | 2023-09-26T22:54:35Z | |
| dc.identifier | GOMES, C. B. Cisteína proteinase B de Leishmania (Viannia) braziliensis : caracterização bioquímica e modulação da expressão durante a diferenciação in vitro. 2017. 100f. Tese (Doutorado em Biologia Parasitária) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2017 | |
| dc.identifier | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/20713 | |
| dc.identifier.uri | https://repositorioslatinoamericanos.uchile.cl/handle/2250/8884638 | |
| dc.description | A Leishmania (Viannia) braziliensis possui um mecanismo adaptativo auxiliado pelas cisteina proteinases B (CPB), uma enzima similar à catepsina L. O foco deste trabalho é estudar a expressão das isoformas dos genes da cpb (LbrM.08.0810, LbrM.08.0820 and LbrM.08.0830) e a atividade enzimática da CPB durante a diferenciação do parasito, induzida pelo choque de pH e temperatura. Tendo como base a sequência a 3\2019UTR dos genes cpb, avaliou-se os níveis de expressão relativa do gene LbrM.08.0810 que revelou uma maior quantidade de transcritos na fase logarítmica dos promastigotas em relação à fase estacionária (> 1.5 x). A expressão dos genes cpb diminuíram durante o choque em pH ácido e após o choque de temperatura, o qual foi seguido por um aumento desta expressão nos demais pontos analisados (> 1,3 x). Os genes LbrM.08.0820 LbrM.08.0830 mostraram perfis de expressão semelhante ao gene LbrM.08.0810, mas em menores níveis. Adicionalmente, a variação dos níveis de cisteína proteinases foram analisadas apartir da flutuação da atividade proteolítica (baseado no substrato Z- Phe-Arg-7-amino-4-metilcoumarina) em amostras de proteína das culturas submetidas a transformação in vitro
Os resultados obtidos mostraram um aumento gradual da atividade enzimática para cada ponto do processo de diferenciação, em relação aos níveis de proteólise em amostras de promastigotas de fase logarítmica (3,1 ± 0,30 mmol min-1.mg proteína-1) a um pico de atividade após 72 horas de incubação a 32 °C (± 4,2 0,30 mmol min-1.mg proteína-1), seguido por uma diminuição aguda após 96 horas de incubação a 32 °C (2,8 ± 0,30 nmol min1.mg protein1). As atividades foram inibidas por Z-Phe- Phe-Fluorometil Cetona e trans-epoxisuccinil-L-leucilamida (4-guanidino) butano, provando se tratar de cisteína proteinases semelhantes à catepsina - L. Utilizando ensaios de ressonância de plasma de superfície, foi possível demonstrar que a enzima recombinante rCPB LbrM.08.0810 é capaz de se ligar à E-64, a pH 5,0 e pH 7,0 com as melhores constantes de equilíbrio. Coletivamente estes resultados indicam pela primeira vez a modulação da expressão e a potencial atividade biológica de catepsina-L símile durante a diferenciação in vitro de L. (V.) braziliensis induzida pelo choque de pH ácido e pelo aumento de temperatura. O conjunto de resultados obtidos nesse trabalho indica que as cisteína proteinases atuam nas etapas de diferenciação da L. (V.) braziliensis | |
| dc.description | Leishmania (viannia) braziliensis presents adaptive mechanisms helped of their proteinases, as cysteine proteinases B (CPB), a cathepsin L-like enzyme. The focus of this work is the cpb gene isoforms (lbrm.08.0810, lbrm.08.0820 and lbrm.08.0830) expression and the cpb enzymatic activity in the parasite during differentiation induced by acid ph and high temperature shocks. We assessed the relative expression levels of the gene lbrm.08.0810 and observed a higher quantity of transcripts in logarithmic phase promastigotes than in stationary phase promastigotes (> 1.5 times). Cbp genes trend to decrease during acid ph shock was followed by an increase after temperature shock, in the all assayed points (> 1.3 times). The genes lbrm.08.0820 and lbrm.08.0830 showed expression profiles similar to the gene lbrm.08.0810, but with overall lower levels. Additionally, the cysteine proteinases levels variation were analyzed by proteolytic activity fluctuation (based on substrate Z-Phe-Arg 7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride) in protein samples from of the cultures submitted to in vitro transformation. The data obtained herein show a gradual increase of enzymatic activity for each point of the differentiation process, from levels of proteolysis in samples of logarithmic phase promastigotes (3.1 ± 0.30 mmol min-1.mg protein-1) to a peak of activity after 72 hours of 32ºc incubation (4.2 ± 0.30 mmol min-1.mg protein-1), followed by an acute decrease after 96 hours of 32ºc incubation (2.8 ± 0.30 nmol min1.mg protein1)
The proteinases activities were inhibited by z-phephe- fluoromethyl ketone and and trans-epoxysuccinyl-l-leucylamido(4- guanidino)butane proving their source as cathepsin-like cysteine proteinases. By using surface plasmon resonance assays, was possible to show that the recombinant rcpb lbrm.08.0810 enzyme is able to bind to the trans-epoxysuccinyll- leucylamido(4-guanidino)butane at pH 5.0 and pH 7.0 with the best equilibrium constants. Collectively these results indicate for the first time the modulation of cathepsin L - like expression and of its potential biological activity during the L. (V.) braziliensis in vitro differentiation induced by acid ph and high temperature. The set of results obtained in this study indicates that the cysteine proteinase acts in the differentiation stages of L. (V.) braziliensis | |
| dc.format | application/pdf | |
| dc.language | por | |
| dc.rights | open access | |
| dc.subject | Leishmania braziliensis | |
| dc.subject | Cisteína Proteases | |
| dc.subject | Catepsina L | |
| dc.subject | Butanos | |
| dc.subject | Cetonas | |
| dc.title | Cisteína proteinase B de Leishmania (Viannia) braziliensiscaracterização bioquímica e modulação da expressão durante a diferenciação in vitro | |
| dc.type | Thesis | |
