Estudo de validação da metodologia qPCR para quantificação do vírus Zika e aplicação de métodos matemáticos para estimativa da sensibilidade analítica

dc.contributorMagalhães, Jorge Lima de
dc.contributorTrindade, Gisela Freitas
dc.contributorMagalhães, Jorge Lima de
dc.contributorTrindade, Gisela Freitas
dc.contributorCarvalho, Erika Martins de
dc.contributorToma, Helena Keiko
dc.contributorFonseca, Erica Louro da
dc.creatorLima, Luiz Augusto Pinto
dc.date2021-07-05T17:29:08Z
dc.date2021-07-05T17:29:08Z
dc.date2020
dc.date.accessioned2023-09-26T22:44:58Z
dc.date.available2023-09-26T22:44:58Z
dc.identifierLIMA, Luiz Augusto Pinto. Estudo de validação da metodologia qPCR para quantificação do vírus Zika e aplicação de métodos matemáticos para estimativa da sensibilidade analítica. 2020. 236 f. Dissertação (Mestrado Profissional em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêutica) - Instituto de Tecnologia em Fármacos / Farmanguinhos, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2020.
dc.identifierhttps://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/47993
dc.identifier.urihttps://repositorioslatinoamericanos.uchile.cl/handle/2250/8882715
dc.descriptionO diagnóstico rápido e o desenvolvimento de vacinas destacam-se como demandas prioritárias para o combate e prevenção de novas epidemias de doenças infecciosas. Neste contexto, a reação em cadeia da polimerase (PCR) permite o diagnóstico da doença com alta sensibilidade e especificidade, além de possibilitar o emprego de metodologias no controle de qualidade e em processos produtivos de vacinas virais. Considerando as fragilidades regulatórias para a validação deste tipo de metodologia como obstáculos para os profissionais da área de análises, esse estudo objetiva-se validar um método de PCR Tempo Real (qPCR) para quantificação de RNA do vírus Zika além da aplicação de quatro abordagens para estimar a sensibilidade analítica (LoD). Para tanto, a eficiência da extração do material genético e a especificidade analítica foram avaliadas mediante investigação de possíveis contaminações cruzadas e amplificações inespecíficas. A reprodutibilidade da curva padrão, a faixa linear, o limite de quantificação (LoQ) e a eficiência de amplificação também foram determinados. A exatidão e as características de precisão (repetibilidade e precisão intermediária) foram investigadas mediante a avaliação da recuperação do vírus alvo inoculado em amostras de soro humano e mediante aplicação do modelo de análise de variâncias (ANOVA). A sensibilidade analítica foi estimada por meio da aplicação do método empírico de diluições, do método de Finney e via aplicação das regressões logit e probit. Desse modo, observou-se que o procedimento de extração se mostrou robusto, mediante aprovação dos controles de extração e amplificação testados. Ademais, a metodologia demonstrou capacidade de detectar o vírus alvo inequivocamente, com ausência de sinais de fluorescência inespecíficos. A curva padrão apresentou reprodutibilidade, possibilitando a estimativa do LoQ como 100 cópias/\03BCL. A faixa linear foi determinada no intervalo 1,7706 - 7,2294 Log10cópias/\03BCL e a eficiência de amplificação média obtida foi 101,6%. Características de exatidão e precisão aceitáveis foram obtidas na faixa de concentração 2,69897 \2013 6,69897 Log10cópias/\03BCL. Os valores de LoD, individualmente estimados, foram 12,5 cópias/\03BCL (método de diluições), 18,89 cópias/\03BCL (método de Finney), 10,35 (probit) e 11,08 cópias/\03BCL (logit). Assim, os resultados permitiram concluir que a metodologia estudada foi considerada possuidora de aceitáveis parâmetros de desempenho, podendo encontrar aplicabilidade no diagnóstico em ensaios clínicos que, por ventura, possam ser executados durante as etapas de desenvolvimento de uma formulação vacinal para prevenção da infecção pelo vírus Zika.
dc.descriptionThe rapid diagnostic and development of vaccines stand out as priority demands to combat epidemics of infectious diseases. In this sense, the polymerase chain reaction (PCR) allows rapid diagnosis of the disease with high sensibility and specificity, besides allowing the use of methodologies in quality control and manufacturing processes of viral vaccines. Keep in mind the lack of regulation to validate this type of methodologies as a challenge for analysis professionals, this work aims to validate a Real Time PCR for quantification of Zika virus and apply four approaches for the analytical sensibility evaluation (LoD). Therefore, material extraction efficiency and the analytical specificity parameter were evaluated by investigation of cross contaminations and non-specifics amplifications. The reproducibility of standard curve, the linear range, the limit of quantification (LoQ) and the amplification efficiency were also evaluated. The trueness and the precision characteristics (repeatability and intermediate precision) were investigated by recovery of target virus inoculated in human serum samples and by statistical tool Analysis of Variance model (ANOVA). The analytical sensibility was estimated individually by the empirical dilutional method, the Finney method and logit and probit regression models. Thereby, the results showed that the extraction procedure was robust, according to the acceptance of extraction and amplification controls. Furthermore, the methodology showed unequivocal capability to detect the target virus, without non-specifics fluorescence signals. The standard curve showed reproducibility, allowing estimating the LoQ at 100 copies/\03BCL. The linear range was determined in the interval 1.7706 \2013 7.2294 Log10copies/\03BCL and the mean value of amplification efficiency was 101.6%. Trueness and precision characteristics were obtained in the range 2.69897 \2013 6.69897 Log10copies/\03BCL. The estimated LoD values were 12.5 copies/\03BCL (by empirical dilutional method), 18.89 copies/\03BCL (by Finney method), 10.35 copies/\03BCL (by probit regression) and 11.08 (by logit regression). Thus, the results allow us to conclude that the methodology showed acceptable performance parameters, providing diagnostic applicability in clinical trials that may be conducted at stages of development of a vaccine formulation to prevent Zika infections.
dc.formatapplication/pdf
dc.languagepor
dc.rightsopen access
dc.subjectPCR Tempo Real Quantitativa
dc.subjectValidação
dc.subjectZika
dc.subjectSensibilidade Analítica
dc.subjectDiagnóstico
dc.subjectQuantitative Real Time PCR
dc.subjectValidation
dc.subjectAnalytical sensibility
dc.subjectDiagnosis
dc.subjectEstudo de Validação
dc.subjectZika Vírus
dc.subjectDiagnóstico
dc.titleEstudo de validação da metodologia qPCR para quantificação do vírus Zika e aplicação de métodos matemáticos para estimativa da sensibilidade analítica
dc.typeDissertation


Este ítem pertenece a la siguiente institución