| dc.contributor | Fragoso, Stenio Perdigão | |
| dc.contributor | Soares, Maurilio José | |
| dc.contributor | Medeiros, Lia Carolina Soares | |
| dc.contributor | Rocha, Wanderson Duarte da | |
| dc.contributor | Godoy, Lyris Martins Franco de | |
| dc.creator | Moreira, Claudia Maria do Nascimento | |
| dc.date | 2018-01-04T16:54:06Z | |
| dc.date | 2018-01-04T16:54:06Z | |
| dc.date | 2017 | |
| dc.date.accessioned | 2023-09-26T22:26:44Z | |
| dc.date.available | 2023-09-26T22:26:44Z | |
| dc.identifier | MOREIRA, Claudia Maria do Nascimento. Caracterização funcional do complexo adaptador 1 (AP-1) em Trypanosoma cruzi. 2017. 90 f. Tese (Doutorado em Biociências e Biotecnologia) - Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas, 2017, Curitiba, 2017. | |
| dc.identifier | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/23872 | |
| dc.identifier.uri | https://repositorioslatinoamericanos.uchile.cl/handle/2250/8879306 | |
| dc.description | O AP-1 é um complexo adaptador heterotetramérico formado pelas subunidades γ, β, μ e σ. Esse complexo auxilia a montagem do revestimento de vesículas com clatrina na rede trans-Golgi, as quais transportam enzimas deste para os lisossomos em células eucarióticas. No entanto, o papel do AP-1 no protozoário Trypanosoma cruzi – o agente causador da doença de Chagas – é totalmente desconhecido. Nesse trabalho, estudamos a função do complexo AP-1 em diferentes formas do ciclo de vida de T. cruzi. Para tanto, foi produzido uma linhagem mutante nulo para subunidade gama (TcAP1-γ) através da técnica de nocaute gênico por recombinação homóloga a fim de aferir uma função para esse adaptador nesse parasita. Outra abordagem foi identificar proteínas associadas à duas subunidades de TcAP-1 (β e μ ) por imunoprecipitação e análise por espectometria de massas. Nossos dados com o parasita nocaute para AP1-γ (TcAP1-γKO) mostraram que formas epimastigotas tiveram sua proliferação e diferenciação para a forma infectiva tripomastigota metacíclicos reduzidas (comparando com parasita selvagem) após a deleção da proteína. Os parasitas TcAP1-γKO também mostraram uma significativa redução na capacidade de infectar células de mamíferos (HeLa e VERO). Outro aspecto relevante é que o nocaute de AP1-γ prejudicou o processamento e o transporte da cruzipaína (principal cisteíno-proteínase de T. cruzi) do complexo de Golgi para os reservossomos (organelas relacionadas aos lisossomos) em T. cruzi. Para confirmar que a ausência da cruzipaína nos reservossomos nos parasitas nocaute era devido à ausência da expressão de TcAP1-γ, parasitas TcAP1-γKO foram transfectados com plasmídeo para expressão epissomal de TcAP1-γ. A complementação da expressão de TcAP1-γ no parasita TcAP1-γKO restaurou a maturação e a localização da cruzipaína nos reservossomos, sugerindo que o complexo TcAP-1 atue na rede trans-Golgi, na formação de vesículas contendo cruzipaína direcionadas aos reservossomos em T. cruzi. Além disso, análise de proteômica das proteínas associadas com TcAP1-β e TcAP1-μ fusionadas à etiqueta GFP, detectaram as subunidades TcAP1-γ e TcAP1-σ do complexo AP-1, mas não detectaram outras possíveis interações. Esse resultado indica que a etiqueta GFP provavelmente interferiu com as associações de AP-1 com outras proteínas auxiliares. | |
| dc.description | The AP-1 Adaptor Complex assists clathrin-coated vesicle assembly in the trans-Golgi
network of eukaryotic cells. However, the role of AP-1 in the protozoan Trypanosoma cruzi
— the Chagas disease parasite — has not been addressed. Here, we studied the function of
AP-1 in different T. cruzi life cycle forms, by generating a gene knockout of the large AP-1
subunit gamma adaptin (TcAP1-γ). Epimastigote (insect form) parasites lacking TcAP1-γ
(TcAP1-γKO) have reduced proliferation and differentiation into infective metacyclic
trypomastigotes (compared with wild-type parasites). TcAP1-γKO parasites have also
displayed significantly reduced infectivity towards mammalian cells. Importantly, TcAP1-γ
knockout impaired maturation and transport to lysosome-related organelles (reservosomes) of
a key cargo – the major cysteine protease cruzipain, which is important for parasite nutrition,
differentiation and infection. To confirm that the absence of cruzipain in the reservosomes of
TcAP1-γKO parasites was due the lack of TcAP1-γ expression, TcAP1-γKO parasites were
transfected with an episomal construct constitutively expressing TcAP1-γ. Complementation
of TcAP1-γ expression in AP1-γKO mutants restored maturation and cruzipain localization to
the reservosomes, implicating the AP-1 complex in the formation of reservosome-bound
vesicles containing cruzipain, at the trans-Golgi network. In addition, proteomics analysis of
complexes associated with GFP-tagged TcAP1-β and TcAP1-μ detected the subunits of AP-1,
TcAP1-γ and TcAP1-σ, but not others possible targets, indicating that GFP probably
interfered with the association of AP-1 with other auxiliary proteins. | |
| dc.format | application/pdf | |
| dc.language | por | |
| dc.publisher | Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. | |
| dc.rights | open access | |
| dc.subject | Trypanosoma cruzi | |
| dc.subject | Molecular Biology | |
| dc.subject | Transport Vesicles | |
| dc.subject | Adaptor Protein Complex 1 | |
| dc.subject | Parasitology | |
| dc.subject | Biologia Molecular | |
| dc.subject | Vesículas Transportadoras | |
| dc.subject | Complexo 1 de Proteínas Adaptadoras | |
| dc.subject | Parasitologia | |
| dc.title | Caracterização funcional do complexo adaptador 1 (AP-1) em Trypanosoma cruzi | |
| dc.type | Thesis | |
