| dc.contributor | Souza, Bruno Solano de Freitas | |
| dc.contributor | Soares, Milena Botelho Pereira | |
| dc.contributor | Fortuna, Vitor Antonio | |
| dc.contributor | Farias, Leonardo Paiva | |
| dc.contributor | Souza, Bruno Solano de Freitas | |
| dc.creator | Sampaio, Gabriela Louise de Almeida | |
| dc.date | 2019-10-03T16:25:00Z | |
| dc.date | 2019-10-03T16:25:00Z | |
| dc.date | 2019 | |
| dc.date.accessioned | 2023-09-26T20:46:25Z | |
| dc.date.available | 2023-09-26T20:46:25Z | |
| dc.identifier | SAMPAIO, Gabriela Louise de Almeida. Geração de linhagens de células tronco pluripotente induzidas com alteração no gene SCN2A e organoides cerebrais como ferramenta para estudo do autismo. 2019. 78 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) – Universidade Federal da Bahia; Instituto Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz, Salvador, 2019. | |
| dc.identifier | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/36148 | |
| dc.identifier.uri | https://repositorioslatinoamericanos.uchile.cl/handle/2250/8863630 | |
| dc.description | Transtornos do espectro autista (TEAs) compõem um grupo de doenças que afetam a interação social, comunicação e comportamento. Nos últimos anos, inúmeras alterações em diferentes genes vêm sendo associadas com TEA. Dentre estes, variantes patogênicas SCN2A vêm apresentando uma forte associação estatística com TEA. O SCN2A codifica a subunidade alfa do canal de sódio voltagem-dependente Nav1.2, que é altamente expresso em células piramidais durante o desenvolvimento do cérebro. Estes neurônios desempenham um papel crítico na organização cortical, excitabilidade e sinaptogênese. Apesar da associação estatística, não há ainda estudos que comprovem a causalidade e os possíveis mecanismos envolvidos na fisiopatologia. Deste modo, a hipótese deste trabalho é de que mutações com perda de função no SCN2A afetam o desenvolvimento do cérebro desde suas etapas iniciais, podendo levar ao desenvolvimento de TEA, e que este processo pode ser estudado in vitro a partir da utilização de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e organoides cerebrais. OBJETIVO: Estabelecerferramentas que permitam a investigação do impacto da mutação do gene SCN2A sobre as fases iniciais do neurodesenvolvimento. MÉTODOS: Células-tronco mesenquimais obtidas de uma paciente portadora de TEA e variante patogênica em heterozigose do gene SCN2A foram reprogramadas utilizando vetores não integrativos para obtenção de uma linhagem de iPSCs (iM5). Esta linhagem foi caracterizada quanto à expressão de marcadores de pluripotência, utilizada em ensaio de formação de corpos embrioides e por análise de cariótipo. Outra linhagem de iPSC,previamente obtida a partir de doador saudável (EB4), foi submetida à edição gênica utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9 para geração de uma linhagem knockout para SCN2A.As iPSCs foram induzidas à formação de organoides cerebrais in vitro, que foram avaliados periodicamente quanto à morfologia e expressão de marcadores relacionados ao desenvolvimento cortical. A expressão do SCN2A foi avaliada nos organoides por PCR e imunofluorescência. RESULTADOS: As linhagens de iPSCs obtidas apresentaram morfologia característica, expressão dos marcadores de pluripotência, cariótipo normal e se diferenciaram em células dos três folhetos embrionários in vitro. A edição do gene SCN2A realizada na linhagem EB4 deu origem à linhagem knockout EB4CRISPR. O protocolo utilizado para formação de organoides cerebrais foi aplicado nas linhagens EB4, EB4CRISPR e EA1, esta última referente à iPSCs de um outro doador saudável. A expressão de SCN2A foi observada nos neurônios presentes no organoide. Foi observada a presença de neurorosetas na 1a semana e, a partir da 3a semana, a presença de células progenitoras Sox2+ mais concentradas nas regiões internas do organoide, com neurônios βIII tubulina+ localizados na região mais externa. Já a linhagem EB4CRISPR formou organoides maiores, com menor expressão de marcadores de diferenciação cortical e desorganização. CONCLUSÃO: Neste trabalho geramos duas linhagens de iPSCs com mutações no gene SCN2A e estabelecemos uma plataforma para geração de organoides que podem utilizados como ferramentas para estudo de doenças do neurodesenvolvimento, como TEAs. Alterações na formação das estruturas do organoide foram identificadas nas células knockout para SCN2A, sugerindo um papel importante deste gene nas etapas iniciais da formação do cérebro. | |
| dc.description | Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. | |
| dc.description | Autism spectrum disorders (ASDs) are a group of diseases that affect
social interaction, communication and behavior. In recent years, a large number of changes in
different genes have been associated with ASD. Among these, pathogenic variants SCN2A
has been presenting a strong statistical association with ASD. SCN2A encodes the alpha
subunit of the voltage-dependent sodium channel Nav1.2, which is highly expressed in
pyramidal cells during brain development. These neurons play a critical role in cortical
organization, excitability and synaptogenesis. Despite the statistical association, there are no
studies that prove the causality and the possible mechanisms involved in its pathophysiology.
Thus, the hypothesis of this work is that mutations with loss of function in SCN2A affect the
initial stages of brain development, which may lead to the development of ASD and that this
process can be studied in vitro by the use of stem cells induced pluripotent (iPSCs) and brain
organoids. OBJECTIVE:Establish a platform to investigate the impact of the gene SCN2A
mutation on early stages of neurodevelopment. METHODS: Mesenchymalstem cells
obtained from a patient with ASD and pathogenic variant in heterozygosis of the SCN2A
gene were reprogrammed using nonintegrative vectors to obtain a lineage of iPSCs (iM5).
This strain was characterized for the expression of pluripotency markers, embryoid body
formation assay and karyotype. Another lineage of iPSC, previously obtained from a healthy
donor (EB4), was submitted to gene editing using CRISPR / Cas9 technology to generate a
knockout lineage for SCN2A. IPSCs were stimulated to differentiate into brain organoids,
which were periodically evaluated for morphology and expression of markers related to
cortical development. The expression of SCN2A was evaluated in the organoids by PCR and
immunofluorescence. RESULTS: The obtained iPSC lineages presented characteristic
morphology, expression of pluripotency markers, normal karyotype and were able to
differentiate into cells of the three embryonic leaflets in vitro. The edition of the SCN2A gene
in the EB4 line generated the EB4CRISPR knockout cell line. The protocol used for brain organ
formation was applied to the EB4, EB4CRISPR and EA1 lines, the latter referring to iPSCs from
another healthy donor. The expression of SCN2A was observed in the neurons present in the
organoid. The presence of neurorosetts was observed in the 1st week andthe 3rd week, the
presence of Sox2+ progenitor cells were more concentrated in the internal regions of the
organoid, with βIII tubulin+ neurons located in the outermost region. The EB4CRISPR line
formed larger organoids, with lower expression of markers of cortical differentiation and
disorganization. CONCLUSION: In this work we generated two lines of iPSCs with
mutations in the SCN2A gene and established a platform for the generation of organoids that
can be used as tools for the study of neurodevelopmental diseases, such as ASDs. Changes in
the formation of organoid structures were identified in the knockout cells for SCN2A,
suggesting an important role of this gene in the early stages of brain formation. | |
| dc.format | application/pdf | |
| dc.language | por | |
| dc.publisher | Instituto Gonçalo Moniz | |
| dc.rights | open access | |
| dc.subject | Autismo | |
| dc.subject | Organoides | |
| dc.subject | Células tronco | |
| dc.subject | CRISPR | |
| dc.subject | Autism | |
| dc.subject | Brain organoids | |
| dc.subject | Stem cells | |
| dc.subject | CRISPR | |
| dc.title | Geração de linhagens de células tronco pluripotente induzidas com alteração no gene SCN2A e organoides cerebrais como ferramenta para estudo do autismo | |
| dc.type | Dissertation | |
