Desenvolvimento de reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex em tempo real com curva de dissociação de alta resolução (HRM) para detecção simultânea e identificação de seis herpesvírus humanos

dc.contributorAraújo, Abelardo de Queiroz Campos
dc.contributorEspíndola, Otávio de Melo
dc.contributorMenezes, Rodrigo Caldas
dc.contributorVieira, Yasmine Rangel
dc.contributorMoreira, Otacílio da Cruz
dc.contributorMello, Cintia Xavier de
dc.creatorSantos, Bruna de Morais Guedes dos
dc.date2022-02-14T21:38:24Z
dc.date2022-02-14T21:38:24Z
dc.date2020
dc.date.accessioned2023-09-26T20:19:19Z
dc.date.available2023-09-26T20:19:19Z
dc.identifierSANTOS, Bruna de Morais Guedes dos. Desenvolvimento de reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex em tempo real com curva de dissociação de alta resolução (HRM) para detecção simultânea e identificação de seis herpesvírus humanos. 2020. 85 f. Dissertação (Mestrado em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas) - Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2020.
dc.identifierhttps://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/51189
dc.identifier.urihttps://repositorioslatinoamericanos.uchile.cl/handle/2250/8854183
dc.descriptionOs vírus do herpes simples (HSV) 1 e 2, o vírus varicela-zoster (VZV), o vírus Epstein-Barr (EBV), o citomegalovírus (CMV), e o herpesvírus humano 6 (HHV-6) apresentam papel etiológico central nas infecções do sistema nervoso central (SNC), e a reação em cadeia da polimerase (PCR) é reconhecida como método de referência no diagnóstico destas infecções. Na literatura, há ensaios de PCR em tempo real que usam sondas do tipo TaqMan, que, embora apresentem alta especificidade, possuem alto custo e restrição do número de sequências alvo. Ensaios com corantes fluorescentes de DNA de dupla-fita permitem o acompanhamento da amplificação de DNA e posterior identificação de amplicons pela temperatura de dissociação (Tm). O corante mais utilizado neste tipo de análise, o SYBRGreen, gera variações na Tm entre as amostras, dificultando a identificação do amplicon. Corantes de DNA de terceira geração, como o EvaGree, têm resolvido esta limitação, pois se ligam de forma saturante ao DNA de dupla-fita, permitindo análises de dissociação com maior confiabilidade, incluindo curvas de dissociação com alta resolução (HRM). Portanto, este projeto teve como objetivo desenvolver PCR multiplex em tempo real para detecção e identificação destes seis herpesvírus. Para tal, iniciadores foram selecionados da literatura, testados in silico quanto à formação de dímeros e ao pareamento com sequências genômicas humanas e, posteriormente, testados em reações individuais com controles de DNA viral e em controles negativos com DNA humano ou água. Iniciadores que se mostraram específicos foram unificados em reação multiplex, e aqueles que geraram dímeros e amplificação inespecífica foram excluídos ou redesenhados As condições de reação foram definidas em ensaios individuais e multiplex, e as taxas de eficiência de amplificação definidas em curvas-padrão construídas com diluições seriadas dos controles de plasmídeos recombinantes contendo os alvos de cada um dos herpesvírus. Também foram definidos o limite detecção e a interferência d amplificação simultânea de dois alvos na detecção viral. Iniciadores para VZV, EBV, CMV e HHV-6 se mostraram específicos na PCR em tempo real, enquanto os iniciadores para HSV-1 e HSV-2 necessitaram de modificações na região 3’ para compor a PCR multiplex. A execução da PCR com etapa de anelamento/extensão a 70ºC, e o uso dos iniciadores a 17,5 pmoles/reação, com exceção dos iniciadores para HSV-1 e HSV-2, que foram utilizados a 10 pmoles, resultou em testes individuais e multiplex com taxas de eficiência entre 93% e 110%. As temperaturas de dissociação obtidas para os amplicons de HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, CMV e Hhv-6 foram de 84,11ºC, 86,83ºC, 82,09ºC, 88,06ºC, 85,30ºC, 79,67ºC, respectivamente. Contudo, os ajustes realizados não foram suficientes para eliminar a formação de dímeros e/ou amplificação inespecífica na PCR multiplex, que ocorreram em faixa de temperatura próxima à Tm do amplicon de HHV-6, o que prejudicou a identificação deste alvo. A análise de curvas convencional e normalizada de HRM foi capaz de identificar os seis herpesvírus nos testes individuais de PCR, com exceção de HHV-6 na PCR multiplex. No entanto, ensaios de amplificação simultânea de dois tipos virais demonstraram que pode haver prejuízo na detecção de um dos alvos, o que é uma limitação inerente aos ensaios multiplex. A análise por curva convencional de HRM apresentou melhor performance em relação à normalizada, sendo obtidos limites de detecção de 100 cópias/reação Amostras com concentrações mais baixas de DNA, em que ocorrem a formação de dímeros e/ou amplificação inespecífica e variações na intensidade de fluorescência, apresentaram a identificação prejudicada na curva normalizada. Dessa forma, a PCR multiplex em tempo real estabelecida neste estudo foi capaz de detectar e identificar cinco tipos virais (HSV-1, HSV-2, VZV, EBV e CMV). No entanto, para a identificação de HHV-6 ainda são necessários ajustes. Com isso, esta PCR multiplex em tempo real pode ser aplicada no diagnóstico qualitativo, para triagem de amostras, e as reações individuais podem ser utilizadas de forma quantitativa
dc.descriptionThe herpes simplex viruses (HSV) 1 and 2, varicella-zoster virus (VZV), Epstein-Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV), and human herpesvirus 6 play a central role in teh etiology of infections of teh central nervous system (CNS). The polymerase chain reaction (PCR) is recognized as a reference method for the diagnosis of these infections. Real-time PCR assays with TaqMan probes are described in the literature, but despite their high specificity, they have elevated cost and a restricted number of target sequences. PCR using fluorescent double-stranded DNA dyes aloow real-time monitoring of DNA amplification and subsequent identification of amplicons by calculation of melting temperature (Tm). The most used dye in this analysis, SYBRGreen, generates Tm variation between samples, making it difficult to identify amplicons. Third-generation DNA dyes, such as EvaGreen, have solved this limitation, as they saturably bind to double-stranded DNA, allowing for more reliable melting analysis, including high resolution melting (HRM) curves. Therefore, we aimed to develop a multiplex real-time PCR for the detection and identification of these six herpesviruses. Thus, primers were selected from the literature, tested in silico for the generation of primer-dimers and aligned to human genomic sequences Subsequently, primers were tested in individual reactions with viral DNA controls, and with negative controls consisting of human DNA or water. Primers that were specific were combined in a multiplex reaction, and those generating primer-dimers and non-specific amplification were excluded or redesigned. Reaction conditions were adjusted in individual and multiplex assays. The amplification efficiency rates were defined with standard-curves constructed with 10-fold serial dilutions of recombinant plasmids containing the target sequence of each virus. The limit of detection and interference of simultaneous amplification of two viral targets were also determined. Primers for VZV, EBV, CMV and HHV-6 were specified, while primers for HSV-1 and HSV-2 required modifications in the 3’ region prior to inclusion into multiplex PCR. Reactions were carried out with annealing/extension step at 70ºC, and primers at 17.5 pmoles/reaction, except for primers for HSV-1 and HSV-2, which were used at 10 pmoles. Individual and multiplex assays presented efficiency rates between 93% and 110%.The mean Tm’s for the HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, CMV and HHV-6 amplicons were 84.11ºC, 86.83ºC, 82.09ºC, 88.06ºC, 85.30ºC, and 79.67ºC, respectively However, adjustments made were not sufficient to eliminate the primer-dimers and non-specific DNA amplification in the multiplex PCR. This occurred in a temperature range close to the Tm respective to HHV-6, which hindered the identification of this virus. Conventional and normalized HRM curves were able to identify the six herpesviruses in the individual PCR, except for HHV-6 in multiplex assays. In addition, the simultaneous amplification of two viruses have shown that there may be impairment in the detection of one of the targets, which is an inherent limitation of multiplex assays. The analysis by conventional HRM curve had better performance in comparison with the normalized curve, with a limit of detection of 100 copies/reaction. Samples containing low DNA concentration, which typically presents the formation of primer-dimers and/or non-specific DNA amplification and variations in the fluorescence intensity, had the identification in the normalized curve impaired. Thus, the real-time multiplex PCR established in this study was able to detect and identify five distinct herpesviruses (HSV-1, HSV-2, VZV, EBV and CMV). However, adjustments are still needed for the identification of HHV-6. In conclusion, this multiplex real-time PCR can be used in the qualitative diagnosis, followed by quantification of viral load in individual reactions
dc.description2500-01-01
dc.formatapplication/pdf
dc.languagepor
dc.rightsrestricted access
dc.subjectHerpesvirus humanos
dc.subjectNeuroinfecções
dc.subjectPCR em tempo real
dc.subjectDissociação de alta resolução
dc.subjectHRM
dc.subjectHuman herpesviruses
dc.subjectNeuroinfections
dc.subjectReal-time PCR
dc.subjectHigh resolution melting
dc.subjectHRM
dc.subjectHerpesvirus Humano 6
dc.subjectHerpes Simples
dc.subjectHerpesvirus Humano 3
dc.subjectHerpesvirus Humano 4
dc.subjectCitomegalovirus
dc.subjectInfecções do Sistema Nervoso Central
dc.subjectReação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
dc.titleDesenvolvimento de reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex em tempo real com curva de dissociação de alta resolução (HRM) para detecção simultânea e identificação de seis herpesvírus humanos
dc.typeDissertation


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