Caracterização funcional dos genes envolvidos na síntese de UDP-Xilose a partir de UDP-Glicose em Trypanosoma cruzi

dc.contributorFragoso, Stênio Perdigão
dc.contributorAugusto, Sávio Peixoto Ramos
dc.creatorLessa, Vinícius Lopes
dc.date2020-11-06T16:08:16Z
dc.date2020-11-06T16:08:16Z
dc.date2019
dc.date.accessioned2023-09-26T20:17:36Z
dc.date.available2023-09-26T20:17:36Z
dc.identifierLESSA, Vinícius Lopes. Caracterização funcional dos genes envolvidos na síntese de UDP-Xilose a partir de UDP-Glicose em Trypanosoma cruzi. 2019. 110 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia) - Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Curitiba, 2019.
dc.identifierhttps://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/44335
dc.identifier.urihttps://repositorioslatinoamericanos.uchile.cl/handle/2250/8853503
dc.descriptionGlicoconjugados são fundamentais para a sobrevivência e infectividade de tripanossomatídeos, atuando desde a proteção contra proteases no inseto vetor aos processos de invasão do hospedeiro mamífero e modulação do seu sistema imunológico. A síntese de glicoconjugados ocorre no Retículo Endoplasmático e no Complexo de Golgi pela adição de monossacarídeos a proteínas e lipideos. Nas reações de glicosilação, nucleotideos-açúcares atuam como os doadores ativados de açúcares. Dentre os tripanossamatídeos mais estudados, devido a sua importância médica (T. brucei, T. cruzi e Leishmania spp.), apenas T. cruzi apresenta os genes necessários para a síntese de UDP- xilose (UDP-Xil) e, de forma correspondente, é o único que apesenta resíduos de xilose em seus glicoconjugados. A síntese de UDP-Xil é feita em duas etapas: primeiramente, UDP-glicose é oxidada pela enzima UDP-glicose desidrogenase (UGD) a UDP-ácido glucurônico (UDP-GlcA); na segunda etapa, ocorre a descarboxilação de UDP-GlcA a UDP-Xil, pela enzima UDP-ácido glucurônico descarboxilase (UXS). Este trabalho tem como objetivo a caracterização funcional dos genes TcUGD e TcUXS de T. cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas. Primeiramente a análise in sílico mostrou que os genes TcUGD e TcUXS possuem apenas uma cópia no genoma do parasita, tornando viável a técnica de nocaute por recombinação homóloga. O nocaute do gene TcUGD foi feito pela substituição dos dois alelos pelos genes de resistência a neomicina e higromicina, sendo a correta inserção dos cassestes confirmada por PCR. Com relação ao gene TcUXS, tentativas para a sua deleção até o momento, não foram bem sucedidas. Após obter o nocaute do gene TcUGD foram feitos ensaios de curva de crescimento, microscopia eletrônica e de fluorescência, localização subcelular, diferenciação e análises em western blot. A curva de crescimento mostrou que a taxa de proliferação das formas epimastigotas do mutante tcugd\0394 é menor em comparação com o parasita selvagem. Por western blot e imunofluorescência, observamos que a glicosilação da proteína GP72 está alterada. De acordo com dados da literatura, em mutantes nulos de gp72, o flagelo se encontra desaderido do corpo do parasita. Apesar disso, experimentos de microscopia eletrônica de varredura e transmissão não mostraram alterações morfológicas aparentes no flagelo dos mutantes de tcugd\0394, o que sugere que a glicosilação de GP72 não é necessária para a sua atividade na adesão flagelar. A localização celular de TcUGD e TcUXS foi investigada pela fusão das proteínas com a etiqueta HA. Os resultados indicam uma possível localização da proteína TcUGD-HA no glicossomo, onde se supõe que ocorra a síntese de nucleotídeos-açúcares em tripanossomatídeos. O papel da xilose na infectividade e diferenciação do parasita ainda tem que ser avaliado, mas os resultados apresentados indicam que, apesar de um açúcar pouco abundante nos glicoconjugados de T. cruzi, níveis adequados de xilose são necessários para crescimento ótimo do parasita em cultura. Além disso, nossos dados indicam uma relação complexa entre a glicosilação de GP72 e sua atividade, que merece um estudo mais detalhado.
dc.descriptionGlycoconjugates are essential for the survival and infectivity of trypanosomatids, acting in processes such as protection against proteases in the insect vector, cell invasion, and modulation of the host immune system. The synthesis of glycoconjugates occurs in the lumen of the Endoplasmic Reticulum and the Golgi apparatus through the addition of monosaccharides to proteins and lipids. Nucleotide sugars act as activated sugar donors in glycosylation reactions. Considering the most studied trypanosomatids due to their medical importance (T. brucei, T. cruzi and Leishmania spp.), only T. cruzi has the genes involved in the synthesis of UDP-Xylose (UDP-Xyl) and, as expected, it is the only one containing xylose residues in its glycoconjugates. The synthesis of UDP-Xyl occurs in two steps: first UDPglucose is oxidized to UDP-glucuronic acid (UDP-GlcA) by UDP- glucose dehydrogenase (UGD), followed by decarboxylation of UDP-GlcA to UDP-Xyl through the action of UDPglucuronic acid decarboxylase (UXS). This work aims to functionally characterize the TcUGD and TcUXS genes in T. cruzi, the etiological agent of Chagas disease. In silico analysis showed that TcUGD and TcUXS are single-copy genes in the parasite genome, making gene knockout by homologous recombination a feasible approach. The knockout of the TcUGD gene was achieved by replacement of both alleles by neomycin and hygromycin resistance genes and the correct insertion of the integration cassettes was confirmed by PCR. With respect for the TcUXS gene, attempts to deletion it for the moment were unsuccessful. After achieved the knockout of the TcUGD gene we did the assays of growth curve, eletronic and fluorescence microscopy, subcelullar localization, diferentiation and analysis on western blot. The growth curve assay reveals that the growth rate of tcugd∆ null mutant epimastigotes was lower compared to the wild type parasite. By western blotting and immunofluorescence analysis, we observed that glycosylation of the GP72 protein was altered. It has been previously shown that a detached flagellum is observed in epimastigote forms. Scanning and transmission electron microscopy experiments, however, didn’t show any apparent morphological changes in the flagellum of Tcugd mutants, suggesting that GP72 glycosylation is not necessary for its activity in flagellar adhesion. The cellular localization of TcUGD and TcUXS was investigated by fusion proteins with the HA tag. The results indicate a possible localization of TcUGD-HA in glycosomes, where nucleotide-sugar synthesis is supposed to occur in trypanosomatids. The role of xylose residues in infectivity and differentiation of the parasite has yet to be addressed, but our results indicated that, despite being a low abundant sugar in T. cruzi glycoconjugates, adequate levels of xylose are necessary for optimal growth of the parasite in culture. Also, our data indicate a complex relationship between the glycosylation of GP72 and its activity, which deserves a more detailed investigation.
dc.formatapplication/pdf
dc.languagepor
dc.rightsopen access
dc.subjectNucleotídeo-Açúcar
dc.subjectGlycoconjugates
dc.subjectSugars
dc.subjectXylose
dc.subjectAzúcares
dc.subjectXilosa
dc.subjectGlycoconjugués
dc.subjectSucres
dc.subjectTrypanosoma cruzi
dc.subjectGlicoconjugados
dc.subjectAçúcares
dc.titleCaracterização funcional dos genes envolvidos na síntese de UDP-Xilose a partir de UDP-Glicose em Trypanosoma cruzi
dc.typeDissertation


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