Hidroxiureia na doença falciforme: influência de polimorfismos nos genes MPO e SERPINA1 e implicações nas vias dos receptores tipo Toll e do Inflamassoma

dc.contributorGonçalves, Marilda de Souza
dc.contributorFertrin, Kleber Yotsumoto
dc.contributorCastellucci, Léa Cristina de Carvalho
dc.contributorRistow, Paula Carvalhal Lage Von Buettner
dc.contributorAraujo, Marco Aurelio Salvino de
dc.contributorGonçalves, Marilda de Souza
dc.creatorPitanga, Thassila Nogueira
dc.date2017-05-03T16:12:03Z
dc.date2017-05-03T16:12:03Z
dc.date2015
dc.date.accessioned2023-09-26T20:11:02Z
dc.date.available2023-09-26T20:11:02Z
dc.identifierPITANGA, T. N. Hidroxiureia na doença falciforme: influência de polimorfismos nos genes MPO e SERPINA1 e implicações nas vias dos receptores tipo Toll e do Inflamassoma. 2015. 157 f. Tese (Doutorado em Patologia) – Universidade Federal da Bahia. Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Salvador, 2015.
dc.identifierhttps://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/18718
dc.identifier.urihttps://repositorioslatinoamericanos.uchile.cl/handle/2250/8850698
dc.descriptionIntrodução: A doença falciforme (DF) é uma condição inflamatória associada a crises vaso-oclusivas e hemólise intravascular. Os polimorfismos nos genes SERPINA1 e mieloperoxidase (MPO) -463G>A estão associados a complicações vasculares na DF. Pacientes com DF são tratadas com hidroxiureia (HU), que aumenta os níveis de hemoglobina fetal (HbF) e diminui a contagem de leucócitos. Os receptores do tipo Toll (TLR) desempenham papel importante na manutenção do estado inflamatório observado nestes pacientes e o inflamassoma associado à proteína 3 do receptor tipo NOD (NLRP3) poderia contribuir para essa inflamação, uma vez que o conteúdo eritróide atua como sinais de perigo (eDAMPs) para ativar esta via. Objetivos: O objetivo geral desse trabalho foi avaliar a possível interferência de polimorfismos nos genes da MPO e SERPINA1 em pacientes com DF na resposta ao tratamento com HU e investigar se esse tratamento pode interferir na expressão gênica de TLR e NOD induzida por hemácias dos pacientes com anemia falciforme (AF). Os objetivos específicos foram avaliar a associação entre esses polimorfismos e aspectos clínicos e laboratoriais em resposta ao tratamento com HU; a expressão de TLR2, TLR4, TLR5 e TLR9 em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de pacientes com AF e o papel que os eritrócitos desempenham na indução da expressão dos TLR, e o efeito in vitro da HU; investigar a expressão de NLRP3, caspase-1, interleucina (IL)-1β e IL-18 em PBMC de pacientes com AF e o papel que os eritrócitos exercem na expressão dessas moléculas, além do efeito in vitro da HU. Métodos: Foram analisadas amostras de sangue de 356 pacientes com DF e 100 voluntários saudáveis. Sessenta e nove pacientes foram rastreados para o polimorfismo -463G>A MPO e 129 para SERPINA1 por métodos baseados em PCR e enzimas de restrição. PBMC e hemácias de pacientes com AF (SS-RBC) e voluntários saudáveis (AA-RBC) foram obtidos. PBMCs foram estimulados com SS- ou AA-RBC na presença de HU. Expressões gênicas de TLRs e NOD foram avaliadas por qPCR. As produções de leucotrieno-B4 (LTB4), IL-1β e proteína ligadora (BP) de IL-18 foram determinadas por ELISA, e a produção de nitrito foi medida pela reação de Griess. Resultados: Entre os pacientes com DF em uso de HU, aqueles com o polimorfismo para MPO apresentaram níveis aumentados de ferritina e de HbF, ao passo que estes parâmetros não estiveram alterados em pacientes tratados e sem o polimorfismo. Em contraste, pacientes com DF com polimorfismo SERPINA1 apresentaram aumento dos níveis de ferritina e diminuição dos níveis de alfa-1 antitripsina (AAT). O tratamento com HU coincidiu com níveis elevados de ferritina em ambos os grupos, ao passo que os níveis de AAT foram reduzidos apenas no grupo mutante. Os pacientes tratados com HU sem polimorfismo SERPINA1 apresentaram redução na contagem de leucócitos e nos níveis de AAT. TLR2, TLR4 e TLR5 estiveram altamente expressos em PBMC de pacientes com AF, em comparação com voluntários saudáveis, enquanto a expressão de TLR9 foi similar em ambos os grupos. Além disso, hemácias intactas de pacientes com AF ou submetidas à lise (SS-RBC), mas não dos voluntários sadios (AA-RBC), induziram a expressão de TLR9, e tanto as AA- quanto SS-RBC lisadas induziram a expressão de TLR2, TLR4 e TLR5. Curiosamente, o tratamento com HU aumentou a expressão de TLR2 e não interferiu na expressão de outros TLRs. Embora SS-RBC induza produção de LTB4 e de nitrito, a HU não impede secreção de LTB4, mas reduz a produção de nitrito. NLRP3 e IL-1β são altamente expressos em PBMC de pacientes com AF quando em comparação com voluntários saudáveis. Adicionalmente, mostramos que SS-RBC intactas ou submetidas à lise, mas não AA-RBC, induziram a expressão de caspase-1 e IL-18, e AA-RBC lisadas induziram a expressão de NLRP3 e IL-1β. Os SS-RBCs íntegros, mas não AA-RBCs, induziram a produção de IL-1β. O tratamento com HU não interferiu na expressão de proteínas do inflamassoma associado ao NLRP-3, ao passo que induziu a produção de IL-18BP. Conclusão: Estes resultados em conjunto indicam que as alterações genéticas, tais como polimorfismos em genes de MPO e SERPINA1, interferem na resposta ao tratamento com HU. Também ficou evidente que hemácias, especialmente SS-RBC, agem como eDAMPs, estimulando a expressão de TLR e NOD, contribuindo para a inflamação. O uso de HU não impede a inflamação dependente de TLR e da plataforma do inflamassoma associada ao NLRP3. Estes conhecimentos podem levar ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que atuem em vias diferentes daquelas observadas para HU.
dc.descriptionCNPq, FAPESB, PPSUS/FAPESB e INCT do sangue
dc.descriptionIntroduction: Sickle cell disease (SCD) is an inflammatory condition associated with vaso-occlusive and painful episodes intravascular hemolysis. SERPINA1 and myeloperoxidase (MPO)-463G>A gene polymorphisms are associated with vascular complications in sickle cell disease (SCD). SCD patients are treated with Hydroxyurea (HU), which increases levels of fetal hemoglobin (HbF) and decreases leukocytes. Toll-like receptors (TLR) play important role in the maintenance of the inflammatory status observed in these patients and the nod-like receptor protein 3 (NLRP3)-inflammasome platform could contribute this inflammation, since erythroid contents acts as danger signals (eDAMPs) for activating this pathway. Objectives: The aim of this study was to evaluate the possible influence of MPO and SERPINA1 genes polymorphisms in SCD patients in response to HU treatment and investigate whether this treatment can interfere with gene expression of TLR and NOD-induced red cells of patients with sickle cell anemia (SCA). The specific objectives were to evaluate the association between these polymorphisms and clinical and laboratory aspects in response to HU treatment; to evaluate the expression of TLR2, TLR4, TLR5 and TLR9 in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of SCA patients and the role that erythrocytes plays in the expression of these TLRs, and in vitro effect of Hydroxyurea; to investigate the expression of NLRP3, Caspase-1, interleukin (IL)-1β and IL-18 in PBMC of SCA patients and the role that erythrocytes plays in the expression of these molecules, and in vitro effect of Hydroxyurea. Methods: Blood samples from 356 SCD patients and 100 healthy volunteers were analyzed. Sixty-nine patients were screened for -463G>A MPO and 129 for SERPINA1 polymorphisms by RT-PCR-based methods. PBMC and red blood cells of SCA patients (SS-RBC) and healthy volunteers (AA-RBC) were obtained. PBMC were challenged with SS- or AA-RBC in presence of hydroxyurea (HU). TLRs and NODs gene expressions were performed by qPCR. Leukotriene-B4 (LTB4), IL-1β and IL-18 bind protein (BP) production were performed by Elisa. Nitrite production was measured by Griess reaction. Results: In the general SCD patients, independent of gene polymorphisms, HU-treated individuals exhibit increased levels of serum ferritin and HbF and reduction of leukocytes count. The MPO polymorphism was associated with reduction in platelet and leukocytes counts. Under HU treatment, patients with MPO polymorphism showed increased levels of ferritin and HbF, whereas these parameters were not changed after treatment of patients without polymorphism. In contrast, SCD patients with SERPINA1 polymorphism presented increased levels of ferritin and decreased levels of Alpha-1 antitrypsin (AAT). HU treatment significantly increased ferritin levels in both groups, whereas AAT were reduced only in the mutant group. HU-treated patients without SERPINA1 polymorphism exhibit reduction in total leukocytes count and AAT levels. TLR2, TLR4 and TLR5 are highly expressed in PBMC of SCA patients, comparing to healthy volunteers, whereas TLR9 expression was similar in both groups. Additionally, intact or lysed SS-RBC, but not AA-RBC, induces TLR9 expression, and lysed, both AA- and SS-RBC, induces expression of TLR2, TLR4 and TLR5. Interestingly, HU treatment increases expression of TLR2 and does not interfere with expression of other TLRs. Moreover, although SS-RBC induces LTB4 and Nitrite, production, HU does not prevent LTB4 but reduces nitrite production. NLRP3 and IL-1β are highly expressed in PBMC of SCA patients when compared to healthy volunteers. In addition, we showed that intact or lysed SS-RBC, but not AA-RBC, induces Caspase-1 and IL-18 expression, and lysed AA-RBC induces expression of NLRP3 and IL-1β. Moreover, Intact SS-RBC, but not AA-RBC, induces production of IL-1β. Treatment with hydroxyurea (HU) showed no interference with the expression of NLRP-3-inflammasome proteins, whereas induced production of IL-18BP. Conclusion: These results together point out that genetic change, such as mutations in MPO and SERPINA1 genes, interfere with the response to HU treatment. In addition, there are more evidence that RBCs, especially SS-RBCs, act as eDAMPs, stimulating TLR and NOD expression and contributing to inflammation. This study highlighted that HU does not prevent TLR- and NLRP3-inflammasome-dependent inflammation. This knowledge could lead to the development of new therapeutic strategies, which act in different ways from those given by hydroxyurea
dc.description2018-12-03
dc.formatapplication/pdf
dc.languagepor
dc.publisherCentro de Pesquisas Gonçalo Moniz
dc.rightsopen access
dc.subjectAnemia falciforme
dc.subjectHidroxiureia
dc.subjectPolimorfismo de mieloperoxidase
dc.subjectGene SERPINA1
dc.subjectInflamação via Toll
dc.subjectInflamassoma
dc.subjectSickle cell anemia
dc.subjectHydroxyurea
dc.subjectMyeloperoxidase gene polymorphism
dc.subjectSERPINA1 gene polymorphism
dc.subjectToll-dependent inflammation
dc.subjectInflammasome
dc.subjectAnemia falciforme
dc.subjectHidroxiureia
dc.subjectPolimorfismo
dc.subjectInflamação
dc.titleHidroxiureia na doença falciforme: influência de polimorfismos nos genes MPO e SERPINA1 e implicações nas vias dos receptores tipo Toll e do Inflamassoma
dc.typeThesis


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