Implementación de un sistema de auto alineación a un microscopio de fluorescencia por hoja de luz (LSFM)

Abstract

La microscopía de fluorescencia de hoja de luz (LSFM) es una técnica de imagen de alta velocidad que permite tomar imágenes de células vivas y grandes volúmenes de tejidos haciendo el mínimo daño a la muestra. LSFM tiene una configuración tal que las rutas de iluminación y detección están separadas siendo perpendiculares. Debido a esto, la calidad a alta resolución de la imagen depende del grado de superposición que haya entre el haz de iluminación y el plano focal de detección. Esta dependencia a largo plazo se ve afectada ya que la posición del haz de luz puede desviarse, afectando su imagen en el detector. Así mismo, el índice de refracción en la muestra puede afectar la incidencia de los fotones emitidos en el detector, provocando que haya un mayor desalineamiento entre el objetivo iluminador y el detector. Por ello, se usan métodos de enfoque automático que vuelvan a alinear el haz de luz con el objetivo detector. Para realizar un aporte a los métodos de enfoque automático y a la toma de datos realizados con LSFM en la Universidad de los Andes, se buscó automatizar un proceso de alineación del LSFM a través del uso de un sistema de traslación motorizados junto métricas de contraste y resolución. Se encontraron en la literatura disponible dos métricas que fueron implementadas. Con las métricas, se creó un algoritmo para desplazar el objetivo de detección usando el motor de paso, hallando que este tenía una relación 0.050 ± 0.001 ¿¿¿m/desplazamiento, donde los desplazamientos son los realizados por el motor. Se implemento este código en la toma de datos de imágenes de microesferas fluorescentes, dónde la más prometedora de las métricas resultó ser una llamada Entropía de Shanon de la Transformada de coseno discreta (DCTS por sus siglas en inglés). Además, se evidenció la desalineación provocada por intervalos largos de tiempo, y cómo el método de autofoco igualmente logra encontrar el sitio dónde se encuentra el máximo resolución.