Análise fosfoproteômica e genômica funcional de linhagens de Leishmania spp. sensíveis e resistentes ao antimônio trivalente

Abstract

A leishmaniose é um complexo de doenças com ampla diversidade epidemiológica e clínica causada por protozoários parasitas pertencentes ao gênero Leishmania. A fosforilação de proteínas é uma das modificações pós-traducionais mais estudadas, que está envolvida em diferentes eventos celulares em Leishmania. Na primeira parte desse estudo, nós realizamos uma análise fosfoproteômica comparativa de linhagens de L. braziliensis sensível e resistente ao antimônio trivalente (SbIII), utilizando eletroforese em gel diferencial bidimensional (2D-DIGE) seguida por espectrometria de massas. Para investigar a abundância diferencial de fosfoproteínas associada com resposta ao estresse induzido à droga e mecanismos de resistência ao SbIII, nós comparamos amostras não tratadas e tratadas com SbIII de cada linhagem. Análises comparativas revelaram um total de 116 spots que apresentaram diferença estatisticamente significativa na abundância de fosfoproteínas, incluindo 11 e 34 spots especificamente correlacionados com estresse devido ao tratamento com a droga e resistência ao SbIII, respectivamente. Foram identificadas 48 proteínas diferentes distribuídas em sete categorias de processos biológicos. A categoria “enovelamento de proteínas/chaperonas e resposta ao estresse” está envolvida principalmente em resposta ao estresse com SbIII, enquanto que as categorias “antioxidante/detoxificação”, “processos metabólicos”, “processamento de RNA/DNA” e “biossíntese de proteínas” estão moduladas no caso de resistência à droga. Alinhamentos de sequências múltiplas foram realizados para validar a conservação de resíduos fosforilados em nove proteínas identificadas nesse estudo. Ensaios de Western blot foram conduzidos para validar a análise quantitativa do fosfoproteoma. Os resultados mostraram níveis de expressão diferencial de três fosfoproteínas nas linhagens analisadas. Na segunda parte desse estudo, análises de Western blot demonstraram que as proteínas nucleosídeo difosfato quinase b (NDKb) e fator de elongação 2 (EF2) estão mais e menos expressas, respectivamente, na linhagem de L. braziliensis resistente ao SbIII, corroborando nossos dados anteriores do fosfoproteoma. NDKb é responsável pela síntese de nucleosídeos rifosfatos e tem papel chave no metabolismo de purina em protozoários tripanossomatídeos. EF2 é um importante fator para síntese de proteínas. A superexpressão dos genes NDKb e EF2 nas espécies L. braziliensis e L. infantum foi realizada para investigar a contribuição destas proteínas no fenótipo de resistência ao SbIII. As linhagens de L. braziliensis superexpressoras de NDKb ou EF2 foram 1,6 a 2,1 vezes mais resistentes ao SbIII do que a linhagem sensível não transfectada. Em contraste, nenhuma diferença na susceptibilidade ao SbIII foi observada em L. infantum superexpressora de NDKb ou EF2. Ensaios de susceptibilidade mostraram que as linhagens de L. braziliensis superexpressoras de NDKb apresentaram elevada resistência à lamivudina, um agente antiviral, mas esta droga não alterou a atividade leishmanicida em associação com SbIII. O clone de L. braziliensis superexpressor de EF2 foi 1,2 vezes mais resistente ao inibidor da quinase de EF2 do que a linhagem sensível. Surpreendentemente, este inibidor aumentou o efeito leishmanicida do SbIII, sugerindo que esta associação pode ser uma estratégia valiosa para a quimioterapia das leishmanioses. Portanto, esse novo estudo nos permitiu determinar o perfil do fosfoproteoma de L. braziliensis, identificando alguns candidatos potenciais para redes bioquímicas ou de sinalização associadas com o fenótipo de resistência ao SbIII neste parasito. Além disso, nossos resultados representam o primeiro estudo de superexpressão dos genes NDKb e EF2 que demonstra um aumento de resistência ao SbIII em L. braziliensis, o que pode contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento das leishmanioses.