A complexidade da interação Leishmania-flebotomíneo: Do estudo de moléculas envolvidas na adesão do parasita ao tubo digestivo à análise do papel de citocinas-like na modulação da resposta imune do vetor

Abstract

As leishmanioses são causadas pelo parasita Leishmania e transmitidas ao vertebrado pela picada do flebotomíneo. Durante o ciclo no vetor, uma etapa crucial ocorre ao fim da digestão com a adesão dos parasitas ao epitélio intestinal do inseto. Nosso grupo anteriormente determinou o papel da proteína flagelar FLAG1/SMP1 de L. major na adesão ao tubo digestivo de P. papatasi. Neste trabalho foram feitos ensaios de interação entre L. major e L. i. chagasi X células embrionárias LL5 e PP9, e também experimentos de inibição da interação entre células PP9 e L. major com adição de proteína recombinante FLAG/MBP. Os resultados mostraram que apesar de haver adesão, a proteína FLAG1/SMP1 parece não ter um envolvimento nesse processo de interação com células embrionárias. Em paralelo, fizemos uma busca por possíveis moléculas ligantes de FLAG1/SMP1, através de experimentos de pull down tanto com lisados de células PP9 quanto de intestinos dissecados de P. papatasi. Nos ensaios com células PP9 identificamos 6 genes de interesse codificantes para proteínas associadas à membrana. Todos esses genes são expressos tanto em intestino quanto em carcaça de P. papatasi. Nos ensaios de pull down com intestinos, identificamos um gene que codifica para uma proteína ligante de ácido hialurônico (AH). Esse gene tem uma tendência a aumento da expressão em intestinos em relação à carcaça de fêmeas não alimentadas. Realizamos também ensaios de microscopia confocal em tubos digestivos pré-incubados com a proteína recombinante FLAG/MBP. Confirmamos que FLAG1/SMP1 interage com o epitélio intestinal de P. papatasi Outra etapa importante da interação parasita-vetor é a resposta imune ativada pela Leishmania dentro do inseto. Nosso grupo detectou previamente a superexpressão de uma TGF-\03B2 de L. longipalpis (LlTGF-\03B2) 72h após infecção por L. i. chagasi. Esse gene foi silenciado com o objetivo de testar o efeito da depleção de LlTGF-\03B2 sobre a resposta imune do inseto. Observamos que a redução de LlTGF-\03B2 gerou um aumento do peptídeo antimicrobiano (PAM) cecropina. Investigamos o efeito do silenciamento em fêmeas infectadas com L. i. chagasi. Com a redução de LlTGF-\03B2, há uma redução drástica de infecção a partir de 48h, além de um aumento da expressão dos PAMs cecropina e defensina 2, além de iNOS indicando que LlTGF-\03B2 pode regular negativamente a expressão de moléculas efetoras da imunidade. Para confirmar os dados obtidos no silenciamento, alimentamos L. longipalpis com L. i. chagasi e anticorpo anti-TGF-\03B2. Observamos uma maior infecção no grupo alimentado com anticorpo após 96h. Posteriormente, verificamos por western blot que o anticorpo utilizado reconhece TGF-\03B2 presente no sangue usado nas alimentações e, possivelmente, o bloqueio dessas moléculas causou o aumento do número de parasitas. Com isso, concluímos que a TGF-\03B2 do sangue tem um efeito inicial de ativação da resposta imune com produção de moléculas efetoras. E que, posteriormente, o contato da Leishmania com o intestino pode estar causando uma ativação do gene LlTGF-\03B2 e uma regulação negativa desses efetores imunes