Efeitos do Heme e propriedades terapêuticas da hidroxiureia no tratamento da anemia falciforme

Abstract

A fisiopatologia da anemia falciforme (AF) é marcada por crises hemolíticas e vasoclusivas intermitentes com aumento da condição redox no microambiente vascular que favorece a cronicidade inflamatória. OBJETIVOS: avaliar a associação do heme com marcadores clínico-laboratoriais em pacientes com AF; o papel de hemácias falciformes íntegras e lisadas na expressão gênica do inflamassoma NLRP3, e se o tratamento de pacientes com hidroxiureia (HU) interfere nesta expressão e na liberação de IL-1β e leucotrieno B4 (LTB4); e investigar as propriedades antioxidantes da HU. MÉTODOS: o heme plasmático de pacientes com AF (n = 80) foi dosado por ELISA, os marcadores laboratoriais foram determinados por métodos automatizados,e as análises genéticas por polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA (RFLP).O histórico clínico dos pacientes foi obtido através de prontuários. Os ensaios de expressão gênica de componentes do inflamassoma NLRP3 (NRLP3, IL1B, CASP1 e IL18) por RT-qPCR foram realizados em células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) de voluntários sadios desafiados com hemácias falciformes íntegras e lisadas (n = 8), e hemácias normais (n = 10); e em leucócitos totais de pacientes com AF tratados (n = 13) ou não tratados com hidroxiureia (HU) (n = 15) e voluntários sadios (n = 20). As determinações de IL-1β e LTB4 foram realizadas por ELISA. A atividade antioxidante foi avaliada por ensaios de varredura usando o radical 2,2-difenil-1- hicrilhidrazila (DPPH). A expressão de superóxido dismutase 1 (SOD1), glutationa peroxidase (GPx), glutationa S-redutase (GSR) e heme oxigenase-1 (HMOX1) foi realizada por RT-qPCR em human umbilical vein endotelial cells (HUVEC) e PBMC. Análises de microarranjo foram realizadas em HUVEC tratadas com HU. RESULTADOS: o aumento no heme livre esteve associado ao aumento de hemoglobina S (HbS),contagem de monócitos, marcadores hepáticos,triglicérides e lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL-C); e a diminuição dos níveis de hemoglobina fetal (HbF) e lipoproteína de alta densidade (HDL-C). O genótipo BEN/BEN esteve associado a níveis mais elevados de HbF que os CAR/CAR. A liberação de heme livre não apresentou associação com os haplótipos, mas foi associada ao histórico clínico de AVC. As hemácias falciformes íntegras e lisadas (SS-RBC) induziram a expressão de componentes do inflamassoma NLRP3 e a secreção de IL-1β e LTB4. SS-RBC íntegras induziram expressão de IL1B com secreção de IL-1β e LTB4, em comparação com SS-RBC lisadas ou hemácias de voluntários sadios (AA-RBC). A diminuição significativa na expressão de NLRP3 e secreção de LTB4 foram observadas em pacientes tratados com HU. A HU apresentou atividade antioxidante em concentrações equivalentes à encontrada no plasma de pacientes tratados com a droga (~200 μM). Os tratamentos com HU ou HU+hemina não induziram toxicidade em PBMC e HUVEC. O tratamento HU+hemina estimulou a produção de nitrato/nitrito em PBMC e HUVEC. A HU aumentou a expressão de SOD1 e GPx em PBMC e HUVEC. O aumento na expressão de GSR foi observado em PBMC e HUVEC tratadas com HU+hemina. O tratamento com HU (ou em combinação com a hemina) não interferiu na expressão de HMOX1 em PBMC quanto em HUVEC. A HU induziu a expressão de SOD2, GSR, GST1 (glutationa S-transferase-1), GSTM2 (glutationa S-transferase mu 2), MGST1 (glutationa S-transferase 1), CBR1 (carbonil redutase 1), proteinas quinases phosphatidylinositol 3-phosphato C (PRKCB, PRKCZ, PIK3C2B) e sequestossomo-1 (p62/SQSTM1). Em contraste, foi observada a diminuição na expressão do fator transcricional BACH1. Upstream analyses demonstraram predição de ativação de Jun, miR-155 e mir-141-3p. CONCLUSÕES:a liberação excessiva de heme a partir de eventos hemolíticos recorrentes pode contribuir substancialmente para a gravidade clínica da AF. Hemácias íntegras e lisadas podem atuar como DAMPs induzindo diferentemente a expressão de componentes do inflamassoma e a produção de IL-1β e LTB4, contribuindo para o estabelecimento da inflamação. O tratamento com HU parece diminuir a inflamação por vias dependentes de NLRP3 e LTB4. A HU apresenta propriedades antioxidantes diretas eliminando radicais livres além de induzir o sistema enzimático de resposta antioxidante via Nrf2 sob regulação do sequestossomo-1. Esses achados podem auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que possam ser utilizadas em conjunto com a indução de HbF visando minimizar a cronicidade inflamatória da AF.