| dc.description.abstract | As leishmanioses são doenças infecciosas causadas por protozoários do gênero Leishmania, transmitidas pela picada de fêmeas de insetos flebotomíneos infectados. As leishmanioses são classificadas como doenças negligenciadas, apresentando grande importância para saúde pública mundial. No Brasil, as espécies de Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) infantum representam grande relevância epidemiológica e causam a leishmaniose tegumentar e visceral, respectivamente. Apesar de atualmente existirem medicamentos disponíveis para o tratamento das leishmanioses, estes apresentam limitações, como alta toxicidade, necessidade de administração parenteral, e ocorrência de parasitos resistentes aos fármacos disponíveis. A descoberta de novos fármacos para o tratamento da leishmaniose é, portanto, fundamental. No entanto, a metodologia clássica para avaliar a susceptibilidade das formas amastigotas às substâncias (contagem as amastigotas intracelulares) não pode ser reproduzida em alta escala, sendo necessário desenvolver uma nova metodologia, que deve ser fácil, rápida, efetiva e de baixo custo. O uso de genes repórteres para seleção de fármacos/substâncias já é utilizado em muitos estudos. O tdTomato consiste em uma variação da proteína fluorescente vermelha clonada do coral Discosoma. Ela é a proteína fluorescente mais brilhante disponível, e pode substituir o uso da luciferase nos ensaios in vivo e in vitro, tornando os ensaios mais rápidos e mais baratos. Nesse contexto, o objetivo desse estudo foi validar o uso de L. (V.) braziliensis e L. (L.) infatum, expressando constitutivamente o gene repórter tdTomato como modelo para triagem em larga escala de substâncias anti-Leishmania. Assim, L. braziliensis e L. infatum foram transfectadas com o plasmídeo pIR1BSD_tdTomato linearizado e a fluorescência vermelha dos clones foi confirmada por microscopia confocal e citometria de fluxo. A microscopia de Lb e Li::tdTomato mostrou que a fluorescência vermelha está distribuída por todo parasito, inclusive no flagelo; e a citometria demonstrou que o brilho dos parasitos é intenso. As formas promastigotas e amastigotas intracelulares dos clones expressando tdTomato de forma constitutiva, foram avaliadas in vitro quanto ao seu perfil de crescimento em cultura e à sua susceptibilidade aos fármacos anfotericina B, antimônio trivalente e miltefosina. O comportamento das linhagens mutantes em relação à curva de crescimento, perfil de infectividade, susceptibilidade aos fármacos foram similares comparados aos parasitos selvagens não transfectados, indicando que a expressão constitutiva do tdTomato não interfere nesses parâmetros avaliados. Além disso, foi possível avaliar a susceptibilidade desses parasitos a fármacos já comercialmente disponíveis, pensando na estratégia de reposicionamento, e a triagem de extratos naturais e substâncias puras possibilitando a descoberta de novas substâncias ativas. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que os parasitos mutantes expressores de tdTomato obtidos podem ser utilizados como modelo em ensaios de avaliação de susceptibilidade de substâncias anti-Leishmania in vitro. A padronização dessa nova metodologia tem como potencial permitir maior rapidez, menor custo e facilidade na triagem de substâncias in vitro contra L. braziliensis e L. infantum. Além disso, essa metodologia pode potencializar a descoberta de substâncias/fármacos ativos para o tratamento das leishmanioses. | |
