Caracterização funcional e estrutural da Proteína TCSUB2 por ensaios bioquímicos, genéticos e espectroscópicos

Abstract

Análises de genômica comparativa mostraram que a conservação dos componentes desta via de exportação de mRNA em espécies de parasitas é baixa quando comparada a outras vias de exportação nuclear. Uma RNA Helicase tipo DEAD box, denominada UAP56 (mamíferos)/Sub2(leveduras), é a mais conservada ao longo da filogenia de eucariotos, sendo essencial para a exportação de mRNA. Ensaios de RNAi em T.brucei demonstraram que essa proteína (TbSub2) também é essencial para a exportação de mRNA em tripanosomatídeos. Contudo, apesar de ser bem conservada, não podemos concluir que esta proteína tenha a mesma função em outras espécies de tripanosomatídeos. Infelizmente, não foi possível obter linhagens para o nocaute do gene (TcSub2) em T.cruzi, nosso modelo de estudo, provavelmente por ser tratar de uma proteína essencial à sobrevivência do parasita. Por isso, o objetivo deste trabalho foi estudar a função e estrutura da proteína TcSub2 através de ensaios enzimáticos, espectroscopia de dicroísmo circular, cromatografia de exclusão molecular, modelagem molecular e complementação funcional em T.brucei. Esta proteína pertence à família de helicases DEAD box que manipulam RNAs estruturados em complexos de proteína-RNA utilizando hidrólise de ATP como fonte de energia. Os ensaios bioquímicos demonstraram que o domínio ATPase de TcSub2 é funcional e a atividade enzimática influenciada pela ligação ao RNA, independente de sequência do RNA. A caracterização funcional e estrutural da proteína mutante, TcSub2K87N, provou que o resíduo conservado K87 é essencial para a hidrólise de ATP e que sua substituição por uma Asparagina não altera sua estrutura secundária e quaternária. A ausência de atividade é devido, provavelmente, à pequenas alterações na estrutura tridimensional que impossibilitam o correto posicionamento do ATP no sítio ativo de TcSub2. Para os ensaios de complementação funcional, foi estabelecida uma linhagem de T. brucei capaz de silenciar a expressão de TbSub2 por RNAi. Esta linhagem será então utilizada para ensaios futuros visando avaliar a semelhança de função e atividade da entre as proteínas de T. brucei e T. cruzi.