Obtenção e caracter ização de uma cepa atenuada de Leishmania Infantum mediante deleção do gene Kharon1

Abstract

Apesar da vacinação ser considerada a melhor estratégia para prevenir a infecção por Leishmania , não existe até o momento nenhuma vacina segura e eficaz para uso humano disponível. As vacinas atenuadas, consideradas padrão - ouro para proteção con tra patógenos intracelulares, tê m sido largamente estudadas como estratégia de imunização contra as leishmanioses. Dessa f orma, c om o objetivo de obter uma cepa atenuada de Leishmania , foi realizado o nocaute do gene Kharon1 ( Kh1 ) em L. infantum , o qual foi descrito como sendo essencial para citocinese das formas amastigotas de L. mexicana . Os mutantes LiKh1 - / - foram obtidos com sucesso por meio de recombinação homóloga e a deleção de ambas as cópias do gene foi confirmada por PCR, qPCR e Southern blot . Em seguida foram também obtido s mutantes complementados nos quais o gene Kh1 foi reinserido nos parasitos LiKh1 - / - ( add - back ). A pesar das formas promastigotas dos mutantes LiKh1 - / - não apresentaram alteração do crescimento quando comparadas com LiWT , parasitos LiKh1 - / - apresentam alteração morfológica, que não é detectada nos parasitos complementados . Apesar de Kh1 estar indireta mente relacionado com o transporte de glicose, os m utantes LiKh1 - / - não apresentaram alteração da captação de glicose e nem alteração na sensibilidade ao antimônio. Por outro lado, as formas amastigotas de LiKh1 - / - foram incapazes de manter a infecção em m acrófagos humanos ou murinos, formando estruturas multinucleadas que não sobrevivem por mais de 16 dias in vitro . A análise do ciclo celular dos mutantes demonstrou que as amastigotas LiKh1 - / - apresentam retenção em G 2 /M, confirm ando que os mutantes LiKh1 - / - apresentaram defeito na citocinese. Os parasitos deficientes em Kh1 também possuem menor capacidade de manter a infecção in vivo , até mesmo em camundongos imunossuprimidos . A deleção do gene Kh1 não interferiu na produção de óxido nítrico pelos macrófag os peritoneais murinos. Os resultados obtidos in vitro e in vivo nesse trabalho demonstram que os parasitos LiKh1 - / - apresentam fenótipo atenuado, devido à alteração na divisão celular. Esses parasitos poderão ser futuramente testados como potenciais candi datos vacinais contra as leishmanioses