Microevolução In Vitro do vírus Dengue, sorotipo-4: estudo de variações genéticas associadas ao aumento da competência viral

Abstract

O vírus Dengue (DENV) pertence à família Flaviviridae e ao gênero Flavivirus, sendo reconhecidos quatro sorotipos distintos denominados DENV-1 a DENV-4. Assim como os demais vírus RNA, o DENV exibe variação em suas sequências, com uma taxa de erro durante o ciclo de replicação estimada em 10-3 a 10-5 erros/nucleotídeo. Essas variações são observadas não só quando analisadas amostras de diferentes indivíduos, mas também dentro de um mesmo hospedeiro. Considerando a necessidade de uma maior compreensão dos mecanismos relacionados ao processo evolutivo do DENV e a emergência de subpopulações virais, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a microevolução in vitro do vírus dengue, sorotipo-4, analisando a existência de variações genéticas associadas ao aumento da competência viral (viral fitness). Para tanto, uma amostra do DENV-4 denominada BrAM005/2011 foi inoculada em células C6/36, sendo realizadas passagens seriadas do vírus nesta linhagem celular até a passagem 25. Finalizadas as passagens, foi realizada extração do RNA viral e o cDNA foi produzido utilizando iniciador específico para DENV-4. O genoma completo da amostra BrAM005/2011 e das passagens 1, 5, 10, 15, 20 e 25 foi obtido pelo método Sanger utilizando sequenciador automático ABI 3130 genetic analyzer e por meio de seq enciamento de nova geração (NGS) utilizando a tecnologia Ion Torrent no equipamento Ion PGM™ System. Os arquivos gerados após as reações de sequenciamento foram analisados utilizando o software Geneious versão 7.1.7. A análise dos dados fornecidos pelo sequenciamento de Sanger mostrou que no decorrer das passagens ocorreram duas mutações de nucleotídeos, sendo uma na região codificante para a proteína do envelope que resultou na substituição de um resíduo de aminoácido e outra na região da proteína NS1, porém esta foi uma mutação silenciosa. Os resultados do NGS corroboraram com os obtidos pelo sequenciamento de Sanger e apresentaram outras dezessete mutações não observadas pelo método anterior, sendo as mesmas nas regiões codificantes para as proteínas E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. Do total de mutações observadas, seis delas resultaram em substituição de resíduo de aminoácido. Considerando as mutações observadas, realizamos o estudo de cinética viral por RT-qPCR utilizando o método de ΔΔCt que indicou um aumento do número de cópias de RNA viral, dependente do tempo pós-infecção, tanto presente no sobrenadante de células infectadas quanto no interior das células, indicando um possível aumento da competência viral. Outros estudos se tornam necessários para confirmar se as mutações aqui encontradas também ocorrem em células de mamíferos e em sistemas in vivo, de maneira a verificar se o aumento do fit ness viral observado neste estudo se repete em outros sistemas.