| dc.description.abstract | O ligante APRIL (do inglês: A Proliferating Inducing Ligand) foi descrito pela primeira vez por Hahne et al, em 1998, e inicialmente caracterizado pela sua capacidade de estimular a proliferação de células tumorais in vitro. Atualmente, três receptores para APRIL são conhecidos: B-Cell Maturation Antigen (BCMA), Transmembrane Activator and CAML Interactor (TACI), os quais são expressos principalmente por linfócitos B, e Heparan Sulphate Proteoglycan (HSPG). BCMA e TACI também são capazes de se ligar ao ligante B-Cell Activation Factor (BAFF), outra proteína da família TNF que compartilha uma alta similaridade estrutural com APRIL. Recentes descrições de camundongos deficientes em APRIL mostraram que essa proteína não é essencial para a manutenção da homeostase do sistema imune saudável, estando associada somente à proliferação de células tumorais, enquanto BAFF é um fator de sobrevivência fundamental para a maturação de linfócitos B. Dessa maneira, como BAFF é um fator crucial para o funcionamento do sistema imune, bloquear a interação de BAFF irá afetar a homeostase imunológica, comprometendo a imunidade do indivíduo.
O objetivo desse trabalho é gerar uma série de peptídeos antagonistas de APRIL, combinando ferramentas computacionais e experimentais. Através da combinação de “Alanine Scanning” computacional com cálculo de energia livre utilizando “Linear Interaction Energy” (LIE) nos complexos APRIL-TACI e BAFF-TACI, foi possível determinar a importância de cada resíduo na estrutura de TACI, apontando a contribuição energética individual para a especificidade da ligação APRIL-TACI. Os coeficientes padrão de LIE foram utilizados. A partir dos resultados de LIE, foram desenhados seis peptídeos mutados, tendo TACI como modelo, com potencial atividade inibitória para APRIL, sem interferir com a estrutura de BAFF:T8: CRKELLKFYDHLLEDCISCANICGQHPRQCAYFC T9: CRKEQFKFYDHLLDDCISCAQICGQHPHQCAYFC T10:CRKEQFKFYDHLLDDCISCAQTCGQHPHQCAYFC T11:CRKEQFKFYDELLDDCISCAQICGQHPHQCAYFC
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T12:CRKELFKFYDHLEDDCISCAQTCGQHPHQCAYFC T13:CRKELFKFYDHLEDDCISCAQSCYQHQHQCAYFC
A estabilidade dos peptídeos foi analisada por dinâmica molecular em complexo com os dois ligantes, APRIL e BAFF, através da avaliação da estrutura secundária ao longo de 30 nanosegundos, quantificação das ligações hidrogênio e pontes salinas, e medição da superfície acessível ao solvente.
Após a dinâmica molecular, os melhores candidatos foram escolhidos em função do aumento do número de pontes de hidrogênio e pontes salinas formadas com APRIL. Os peptídeos T12 e T13 foram excluídos devido à perda da estrutura secundária inicial. Os quatro melhores candidatos, do ponto de vista computacional, foram clonados em bactérias e os plasmídeos foram transfectados em células eucarióticas 293T. Seguiu-se então a purificação do sobrenadante produzido pelas células transfectadas. O sucesso da transfecção foi confirmado por imunoblotting. A atividade inibitória desses peptídeos foi testada por ELISA após a purificação. Dentre os quatro peptídeos, dois foram capazes de reduzir sensivelmente a densidade ótica, indicando que houve efeito inibidor para esses peptídeos. Os resultados apontam que a estratégia elaborada nesse trabalho pode ser aplicada ao desenho de sequências peptídicas direcionadas à inibição de um alvo proteico específico. | |
