Edição genômica como estudo da regulação da expressão do hormônio de crescimento na síndrome de Prader-Willi

Abstract

A síndrome de Prader-Willi (SPW) é associada a distúrbios neurológicos, comportamentais e diversas deficiências hormonais, incluindo o hormônio do crescimento (GH). Embora o tratamento de reposição do GH melhore a composição corporal, o crescimento e o quadro clínico geral, esta não é uma cura e suas bases clínicas ainda são desconhecidas na síndrome. A SPW ocorre por três mecanismos moleculares: deleção paterna da região 15q11-q13; dissomia uniparental materna 15; ou defeitos de imprinting. A linhagem celular GH3 de pituitária de rato foi utilizada por ser um modelo bem estudado de células secretoras de GH e prolactina. Utilizando o sistema CRISPR-Cas9, realizamos a deleção completa da região ortóloga da SPW de 3,2 Mb na linhagem GH3, produzindo o genótipo da síndrome in vitro, para investigar quais segmentos gênicos da SPW estão envolvidos na regulação do GH. A investigação de off-targets por sequenciamento Sanger revelou desde reparos sem alteração nucleotídica até grandes rearranjos nos flancos dos sítios-alvo dos gRNAs, inclusive com inserções não previstas de DNA exógeno. Nossos dados ressaltam a necessidade de projetar cuidadosamente as condições experimentais e caracterizar minuciosamente os materiais genéticos obtidos pelo sistema CRISPR-Cas9. A análise do DNA no flanco proximal da região da SPW em ratos demonstrou sequências que podem representar o marco inicial do silenciamento gênico por imprinting na região, assim como ocorre próximo a UBE3A em humanos na porção distal da região ortóloga. Os quatro modelos de sublinhagens SPW-Knockout gerados neste trabalho com deleções de 3,2 Mb envolvendo toda a região da SPW permitirão compreender melhor a relação entre os genes da síndrome e as vias moleculares envolvidas na regulação do GH, além da sua utilização como modelos em novos estudos sobre a SPW. O gene SNORD107 surgiu como o principal candidato a regular o GH dentro da região da SPW, podendo formar um complexo ribonucleoprotéico que exerceria função regulatória pós-transcricional na cadeia de produção do GH.