O papel das integrinas de células epiteliais na secreção de citocinas induzida por paracoccidioides brasiliensis

Abstract

Paracoccidioides brasiliensis é um dos agentes etiológicos da paracoccidioidomicose (PCM), micose humana sistêmica mais prevalente na América Latina. Uma vez nos pulmões, P. brasiliensis interage com células epiteliais, ocasionando a ativação de vias de sinalização que culminam na modulação da resposta imune inata do hospedeiro, ao promover a secreção de citocinas. Nesta dissertação, investigamos o envolvimento de integrinas na secreção das citocinas IL-6 e IL-8 por células epiteliais pulmonares humanas A549 na presença de leveduras de P. brasiliensis. Além disso, analisamos se durante a interação A549-P. brasiliensis ocorre o recrutamento destes receptores para "membrane rafts" e se estes domínios de membranas celulares são importantes para a secreção de IL-6 e IL-8 por estas células epiteliais. Demonstramos que P. brasiliensis induziu aumento na expressão de integrinas alfa3, alfa5 e beta1 em células A549 e que estas integrinas foram capazes de se ligar a leveduras deste fungo. Utilizando RNA de interferência, observamos que o silenciamento de integrinas alfa3 e alfa5 em células A549 promoveu redução nos níveis de IL-6 e IL-8 nos sobrenadantes de cultura durante interação com P. brasiliensis, o que sugere o envolvimento destes receptores na secreção de citocinas por células A549. A partir do isolamento de membranas resistentes a detergente (DRMs), que contêm "membrane rafts", demonstramos que este fungo promove o recrutamento de integrinas alfa3, alfa5 e beta1 para estes domínios de membranas celulares. Utilizando metil-beta-ciclodextrina, mostramos que o recrutamento de integrinas para "membrane rafts" foi dependente de colesterol. Além disso, verificamos que a nistatina (composto que desorganiza "membrane rafts") reduziu a secreção de IL-6 e IL-8 por células A549 infectadas com P. brasiliensis, indicando que "membrane rafts" estão envolvidos na secreção destas citocinas. Deste modo, demonstramos o envolvimento de integrinas e "membrane rafts" na secreção de IL-6 e IL-8 por células epiteliais A549 infectadas com leveduras de P. brasiliensis.

Paracoccidioides brasiliensis is one of the etiologic agents of paracoccidioidomycosis (PCM), the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Once in the lungs, P. brasiliensis interacts with epithelial cells, resulting in the activation of signaling pathways which culminates in modulation of the innate host immune response, promoting the cytokine secretion. In this thesis, we investigated the involvement of integrins in the secretion of IL-6 and IL-8 cytokines by the human lung epithelial cells A549 in the presence of P. brasiliensis yeasts. In addition, we analyzed the occurrence of the recruitment of these receptors to membrane rafts during the A549-P brasiliensis interaction, and whether these membrane domains are important for IL-6 and IL-8 secretion by these cells. We demonstrated that P. brasiliensis increased the expression of alpha 3, alpha 5 and beta1 integrins in A549 cells, and that, these integrins are capable of binding to this fungus yeasts. Using RNA interference, we observed that silencing of alpha3 and alpha5 integrins in A549 cells promotes a reduction in IL-6 and IL-8 levels in A549 culture supernatants during interaction with P. brasiliensis, suggesting the involvement of these receptors in cytokine secretion by A549 cells. We also demonstrated that this fungus promoted the recruitment of alpha3, alpha5 and beta1 integrins to detergent-resistant membranes fraction (DRM). Using methyl-beta-cyclodextrin, we show that recruitment of integrins to membrane rafts was dependent on cholesterol. Furthermore, we found that nystatin (compound that disrupts membrane rafts) reduced the secretion of IL-6 and IL-8 in A549 cells infected with P. brasiliensis, indicating that membrane rafts were involved in the secretion of these cytokines. Thus, we have demonstrated the involvement of integrins and membrane rafts on IL-6 and IL-8 secretion by epithelial A549 cells infected with P. brasiliensis yeasts.